Nació en Madrid. Su padre, natural de Badajoz y proveniente de una familia de militares de carrera, era controlador aéreo, y su madre, nacida también en Badajoz, era maestra.

Pedro Duque se licenció en 1986 en la Escuela Técnica Superior de Ingeniería Aeronáutica y del Espacio de la Universidad Politécnica de Madrid, siendo el segundo de su promoción, a pesar de tener una nota media de 10. En ese mismo año comenzó a trabajar en el grupo empresarial español GMV, donde fue destinado al Centro Europeo de Operaciones Espaciales en Darmstadt (Alemania) para realizar trabajos en el marco de la Agencia Espacial Europea. En 1992, fue seleccionado en uno de los concursos que realiza dicha agencia para buscar personas que puedan desarrollar la labor de cosmonauta.

Se preparó en la Ciudad de las Estrellas de Moscú (Rusia) y en los Estados Unidos. Su primera misión espacial fue la STS-95 del transbordador espacial Discovery, entre octubre y noviembre de 1998, de nueve días de duración, durante la cual supervisó el módulo experimental de la Agencia Espacial Europea (ESA). En octubre de 2003, Duque participó en otro viaje, en el cual fue lanzado en una nave Soyuz TMA, realizando la labor de ingeniero de vuelo y visitando la Estación Espacial Internacional durante diez días para la realización de la Misión Cervantes 2​.

Desde noviembre de 2003 hasta octubre de 2006 trabajó en la ETSI Aeronáuticos de la Universidad Politécnica de Madrid,3​ como director de Operaciones del USOC español, habiendo impartido varias conferencias para alumnos tanto de la ETSI Aeronáuticos como de la EUIT Aeronáuticos en el marco de un curso de libre elección denominado "Ciencia y operaciones en el espacio".

En el año 2006 fue nombrado director general de Deimos Imaging, S. L., una empresa situada en el Parque Tecnológico de Boecillo (Valladolid) que el 29 de julio de 2009 puso en órbita el primer satélite español de observación de la Tierra que permite mejorar el uso de la tierra en agricultura, avanzar en la detección y el control de incendios, y velar por la salud de los bosques. En 2010 asume el cargo de presidente ejecutivo de esta compañía en sustitución de Francisco Javier Martínez de Irujo.

En octubre de 2011 Duque retornó a la Agencia Espacial Europea después de su excedencia, donde retomó su puesto de astronauta. Desde 2011 hasta 2015 lideró la Oficina de Operaciones de Vuelo, con responsabilidad sobre las actividades europeas en la Estación Espacial Internacional. Después fue responsable de revisión de proyectos futuros de la ESA para vuelos tripulados, dentro del cuerpo de astronautas de la ESA.

El 6 de junio de 2018 se anunció su nuevo cargo como ministro de Ciencia, Innovación y Universidades del Gobierno de España bajo la presidencia de Pedro Sánchez.