Metodologías que ofrece LIPRONAT.
Conceptos básicos de las métodologias utilizadas en LIPRONAT.
El secado de la materia vegetal es el primer paso para la obtención del extracto, ya que el exceso de agua en drogas vegetales es el responsable del crecimiento de bacterias y hongos, por ello el material vegetal se lleva a secar en un horno de convección forzada a temperaturas no mayores a los 40°C para hojas, esto para evitar la perdida o degradación de sus constituyentes, mientras que para corteza y raiz la temperatura debe ser no mayor 60°C ya que el material presenta una mayor consistencia en su estructura.
El ensayo consta de evaluar si la humedad de la materia vegetal es igual o menor al 10%, por ello el méto utilizado es la termogravimetría la cual se basa en determinar una pérdida de masa, que se produce al calentar una substancia. Para esto, la substancia se pesa antes y después del calentamiento, y a continuación se calcula la diferencia entre ambos pesos registrados.
El método de mejor solvente se basa en la cantidad de materia sólida que se puede disolver en un disolvente o mezcla de estos. Para llevar a cabo este proceso, es necesario someter las muestras a una temperatura de 110°C para evaporar el solvente. De esta manera, se puede determinar cuál de las mezclas tiene la mayor capacidad de retener los metabolitos importantes de la droga vegetal al analizar el residuo resultante.
El método consiste en separando químicamente los componentes de la materia vegetal con el uso de disolventes con diferentes polaridades, obteniendo así, extractos con metabolitos de diferentes polaridades.
El uso del rotavapor consiste en concentrar los extractos obtenidos a partir de la percolación. El proceso de concentración tiene como objetivo aumentar el contenido de sólidos en el extracto para lograr un determinado contenido de residuo seco. Este proceso se utiliza para fabricar extractos suaves como etapa preliminar en la producción de extractos secos. Además, los extractos también pueden ser concentrados para su extracción en contracorriente con solventes no miscibles, con la finalidad de producir extractos purificados o aislar sustancias puras.
Consiste en desecar en un horno, un determinado peso de extracto durante un tiempo determinado, y a continuación se deja enfriar en un desecador. El resultado se expresa en porcentaje (m/m) respecto al extracto inicial.
El método de extracción utilizado por el neoclevenger es la hidrodestilación, este consiste en que tanto el material a ser extraído como el solvente empleado en la extracción se tienen en un recipiente con un sistema de calor que le permite agregar energía lo que incrementa la temperatura del solvente hasta alcanzar la temperatura de ebullición.
A medida que la temperatura del solvente aumenta, los metabolitos de interés contenidos en las células del material extraído migraran del seno del material hacia el solvente. Los componentes volátiles comenzaran a evaporarse en equilibrio con el vapor del solvente.
La extracción de aceites se basa en la separación del líquido, de un sistema de dos fases sólido-líquido mediante la compresión, este método de extracción exclusivamente mecánico se realiza a baja temperatura, preservando de este modo la proporción de ácidos grasos esenciales, vitamina E, antioxidantes naturales y no necesita ningún aditivo.
La destilación consiste en un método que utiliza la ebullición y condensación para separar diferentes componentes líquidos de una mezcla a partir de la diferencia de sus puntos de ebullición.
Extracción sólido-líquido, consiste en el lavado sucesivo de una mezcla sólida con un determinado solvente que va extrayendo de la mezcla los componentes más solubles en él.
Las propiedades organolépticas son todas aquellas propiedades que se pueden captar a través de los sentidos.
Para ello se debe determinar el olor, a partir de una descripción con patrones de referencia y se compara y se determina si corresponde con el olor característico del producto.
La apariencia se deescribe en términos de brillantez de la superficie, homogeneidad, presencia de gránulos, presencia de partículas extrañas, etc.
Se observa el color, que puede describirse como máximo en tres términos: color principal, matiz e intensidad.
La identificación de una droga se realiza comparándola con una droga patrón, con descripciones pormenorizadas de distintas farmacopeas y en literaturas especializadas.
El estudio microscópico de una droga vegetal (en estado fresco), exige la elaboración de cortes del material de estudio. Estos pueden ser hechos a mano libre o con un micrótomo y se seleccionan los más delgados y parejos. También se pueden utilizar técnicas de aclarado y tinción del material vegetal para la mejor observación de algunas estructuras.
La identificación macroscópica se vale de los órganos de los sentidos: visión (aspecto general: entera, fragmentada, pulverizada), tacto (superficie: lisa, rugosa, tomentosa; consistencia: dura, flexible, coriácea, memebranácea, parpirácea, carnosa o suculenta), sabor, sensaciones (astringente, oleoso, mucilaginoso, acre, pungente) y olfato. Se debe tener en cuenta el órgano vegetal ya que cada uno de estos posee características morfológicas que le son propias.
Los ensayos histoquímicos ayudan en la identificación de una droga mediante la determinación de la presencia o ausencia de metabolitos secundarios en los tejidos vegetales, en comparación con una droga patrón o con las descripciones pormenorizadas en literaturas especializadas de la droga vegetal de la que se cree se trata la droga problema. Estos ensayos sirven como complemento a los ensayos de identidad micro y macromorfológicos, y por si solos no nos dan información mínima necesaria para asegurar la identidad de la droga vegetal.
En este proceso se debe determinar la suma de otras partes de la propia planta y de la materia orgánica e inorgánica extrañas, que generalmente no debe estar en más de un 2%, a menos que se especifique otro límite.
Se denomina cenizas totales a la materia inorgánica (sales minerales) que forma parte constituyente de la material vegetal seca. Las cenizas permanecen como residuo luego de la calcinación de la materia orgánica. La calcinación debe efectuarse a una temperatura adecuada, que sea lo suficientemente alta como para que la materia orgánica se destruya totalmente, pero la temperatura no debe ser excesiva para evitar que los compuestos inorgánicos sufran alteración (fusión, descomposición, volatilización o cambio de estructura). La prueba de ceniza total indica el contenido de minerales que contiene el material en estudio.
El tamizaje fitoquímico o screening fitoquímico es una de las etapas iniciales de la investigación fitoquímica, que permite determinar cualitativamente los principales grupos de constituyentes químicos presentes en una planta y a partir de allí, orientar la extracción y/o fraccionamiento de los extractos para el aislamiento de los grupos de mayor interés.
La cromatografía en capa fina consiste en la separación de los componentes de una mezcla a través de la migración diferencial sobre una capa fina de adsorbente, retenida sobre una superficie plana. En está técnica, una solución de la muestra que va a ser analizada se aplica por medio de un capilar sobre la superficie de un adsorbente inerte (sílica, alúmina, etc) distribuido sobre una placa de vidrio o de aluminio. La placa se coloca verticalmente dentro de una cámara previamente saturada con el vapor del eluente adecuado. El eluente va a migrar por capilaridad en la placa cromatográfica, separando por migración diferencial los diversos componentes de la mezcla a ser estudiada.
El ensayo macrométrico consiste en la determinación de metaboltitos secundarios de la planta a partir del uso de disolventes apropiados y aplicación de reacciones de coloración que permitan la identificación visible de los metabolitos de interes, este ensayo debe permitir la evaluación rápida, con reacciones sensible, reproducibles y de bajo costo.
La determinación se basa en reacciones de coloración con anisaldehído, ácido sulfúrico y acetato de etilo, con lo cual se forma un cromóforo con el mismo espectro de absorción, y un único picoa 430 nm para todas las siguientes sapogeninas: diosgenina, trigogenina, hecogenina, smilagenina, yomogenina, tokorogenina, etc.
Son compuestos polifenólicos caracterizados por una estructura química basada en un esqueleto C6-C3-C6, esto es un anillo bencénico unido a una cadena propánica y esta a su vez a otro anillo bencénico.
Muchos presentan fluorescencia a la luz ultravioleta (UV) que puede modificarse en medio básico, con los agentes quelantes. Generalmente se identifican por cromatografía en capa fina y revelado al UV, también se pueden cuantificar mediante métodos espectrofotométricos.
Artemia Salina es una especie animal característico que al reventar los quistes se transforman en pequeños camarones de cuerpo blando y de un color naranja suave, transparentes a la luz, el uso de Artemia en ensayos presenta una serie de ventajas, ya que los quistes tienen años de duración y poseen una alta sensibilidad los tóxicos, esto genera que Artemia sea un elemento clave dentro de los estudios biológicos.
Las bacterias son organismos de vida libre que tienen curvas de crecimiento máximo de 24 a 48 horas en medios artificiales específicamente diseñados. El tamizaje de la actividad antibacteriana consiste en poner de manifiesto la inhibición del crecimiento de una bacteria determinada en condiciones estándar con una concentración previamente determinada como punto de corte (500-1000 mg/mL) de un extracto, fracción o compuesto obtenidos de una droga vegetal.
Consiste en la cuantificación de la concentración mínima de un extracto, fracción o compuesto (originado de una droga vegetal) que previene el crecimiento visible de microorganismos, es decir, que ha demostrado su actividad en una prueba de tamizaje previo. Para su realización se emplean diluciones seriadas del extracto y concentraciones constantes del microorganismo y se evalúa el crecimiento del microorganismo en un ensayo estandarizado similar al que sirvió de tamizaje.
Los hongos son organismos de vida libre que tienen curvas de crecimiento máximo de 7-28 días en medios artificiales específicamente diseñados. El tamizaje de la actividad antimicótica consiste en evidenciar in vitro como un extracto, fracción o compuesto derivado de una droga vegetal inhibe el crecimiento de un hongo en condiciones estándar. Siempre y cuando se maneje una concentración previamente determinada conocida como punto de corte (entre 500-1000 mg/mL).
Las levaduras son organismos de vida libre que tienen curvas de crecimiento máximo de 48-72 horas en medios artificiales específicamente diseñados. El tamizaje de la actividad antilevadura consiste en evidenciar in vitro como un extracto, fracción o compuesto derivado de una droga vegetal inhibe el crecimiento de un hongo levaduriforme en condiciones estándar. Siempre y cuando se maneje una concentración previamente determinada conocida como punto de corte (entre 500-1000 mg/mL).
El método presenta la capacidad de la sustancia antioxidante de estabilizar el radical DPPH, esto por medio de la donación de un átomo de hidrogeno, que genera la reducción del DPPH a DPPH-H, provocando un cambio en su color morado inicial a un tono amarillo. Este método a diferencia de ABTS y FRAP presenta mayor estabilidad.
Método basado en la capacidad de las sustancias antioxidantes de reducir el ion férrico al estado ferroso; de esta forma, el ion forma un complejo coloreado con el compuesto 2,4,6-Tripyridyl-s-Triazine (TPTZ), dicha acción se basa en la capacidad de reducción por transferencia de electrones y no por neutralización de radicales libres.
Método basado en la capacidad de la sustancia antioxidante de estabilizar el radical catión ABTS+, el cual es formado previamente por la oxidación del ABTS (2,2´-azinobis (3-etilbenzotiazolina-6- ácido sulfónico)) por metamioglobina y peróxido de hidrógeno.
Cuantificación basada en una reacción colorimétrica de óxido-reducción, en la cual el agente oxidante utilizado, es el reactivo de Folin-Ciocalteu.
Londoño, J. (2012). Antioxidantes: importancia biológica y métodos para medir su actividad. In Desarrollo y Transversalidad serie Lasallista Investigación y Ciencia. Corporación Universitaria Lasallista.
Zarate, J. (2019). Validación de la técnica de DPPH-CLAR como método para la actividad antioxidante de metabolitos secundarios lipofílicos extraídos de actinobacterias. [Tesis de licenciatura: Química Farmacéutica Bióloga]. México: Universidad Autónoma Metropolitana, Unidad Xochimilco. https://repositorio.xoc.uam.mx/jspui/retrieve/fc426bfb-7972-4fee-8709-613b434fcaae/cbs1972737.pdf
REAL FARMACOPEA ESPAÑOLA (2002) 2ª Ed. Madrid: Ministerio de Sanidad y Consumo. 2801 p.
Solis, P. et.al. 2004. Manual de Caracterización y Análisis de Drogas Vegetales y Productos Fitoterapéuticos. Proyecto de Desarrollo de Tecnología de Cultivo de Plantas Medicinales y Producción de Fitoterápicos. Organización de los Estados Americanos y la Agencia Interamericana de Cooperación para el Desarrollo. Centro América. 65-66 p.
Caldas, A. (2012). Optimización, escalamiento y diseño de una planta piloto de extracción sólido líquido. Ecuador: Universidad de Cuenca.
Kuklinski, C. (2000). Farmacognosia. Estudio de las drogas y sustancias medicamentosas de origen natural. Omega. Barcelona. 515 p.
Solís, P.N.; Guerrero de Solís, N.; Gattuso, S. y Cáceres, A. s.f. Manual de caracterización y análisis de drogas vegetales y productos fitoterapéuticos. Proyecto desarrollo de tecnología de cultivo de plantas medicinales y producción de fitoterápicos. OEA/ AICD/ AE 089/03.
MacCarthy P et al. 1992. Antifungical activity of meridine. A natural product from the marine sponge. J. Nat. Prod. 55: 1644-1668.
Brancato FP & Golding NS. 1983. The diameter of the mould colony as a reliable measure of growth. J. Mycol. 45:848-863.
Burlingame EM & Reddish GP. 1973. Laboratory methods for testing fungicides used in the treatment of epidermophytoses. J. Lab. Clin. Med. 14:649-653.
Mitscher LA et al. 1972. Antimicrobial agents from higher plants. 1. Introduction, rationale and methodology. Lloydia 35: 157-166.