MP7. Tècniques immunològiques

Objectiu de la pràctica:

En aquesta practica volem quantificar la concentració de anticossos igG d'una mostra problema.

Tècnica:

Utilitzarem una técnica de turbidimetria, es a dir, la unió antigen-anticós provoca un entramat insoluble que dona un canvi d'absorbància que es podrà llegir a l'espectofotometre. És una técnica de unió secundària, ja que, el que estem valorant es un precipitat que es forma després de la unió Ag-Ac.

Fonament: En aquesta pràctica, aprendrem a quantificar la concentració d’anticossos de tipus IgG d'una mostra problema. Per fer-ho, utilitzarem anticossos anti-IgG, que formaran compostos insolubles quan es combinen amb la IgG de la mostra del pacient ocasionant un canvi d'absorbància proporcional a la concentració d'IgG de la mostra. Aquest canvi d’absorbància es pot quantificar per comparació amb un calibrador d'IgG de concentració coneguda

Significat clínic: La IgG és la immunoglobulina més important produïda per cèl·lules plasmàtiques, i representa un 75% del total d'immunoglobulines. La seva funció principal és neutralitzar toxines en l'espai tissular. El dèficit d'IgG pot ser degut a problemes congènits primaris (immunodeficiència congènita i adquirida) i suposa un risc especial en infants. Per altra banda, la hiperglobulinèmia policlonal és dóna en la resposta a infeccions, hepatitis, cirrosis i algunes malalties autoimmunes. En algunes patologies com el mieloma múltiple, la leucèmia limfocítica i la macroglobulinemia de Waldenström s'observen increments d'IgG monoclonal.

Reactius:

• Calibrador de proteínes (PROT-CAL). Que es troba en una concentració de 798 mg/dL.

• R1: Anticossos de cabra anti-igG humà. Tris 20mmol/L, pH 8.2, azida sódica 0,95 g/L. L'afegirem a la nostra mostra per provocar l'entramat antigen-anticós.

• Mostra problema: mostra de serum problema que volem determinar [IgG].

Material adicional:

• Bany aigua a 37'C.

• Espectofotòmetre.

PROCEDIMENT:

1. Preparar la corba de calibració

Necessitarem 6 eppendorfs on posarem les dilucions seriades.

El PROTCAL ens serà util per construir una corba de calibració. Farem dissolucions seriades 1/2 d'aquest reactiu. Així construirem una corba de concentracions i absorbàncies per poder comparar la nostra mostra i poder extrapolar la seva concentració. En aquesta corba utilitzarem un blanc, que no conté el solut que absorbeix la llum, només diluent (NaCl). Es important per posar l'espectofotometre a 0 i que tot allò que mesuri sigui consequència del solut i no del diluent. (Fig1).

2. Realitzar la tècnica inmunològica:

En aquesta part necessitarem 6 tubs eppendorf més per traspassar les mostres de la corba de calibració i un eppendorf per a la mostra.

Una vegada tenim les mostres de la corba de calibració preparades realitzarem la tècnica immunològica en nous tubs eppendorf. En aquesta, analitzarem les mostres de la corba de calibració (tenen concentració coneguda) i també la mostra problema de la qual volem determinar la concentració d’IgG.

1. Atemperar els reactius a 37ºC.

2. Preparar els tubs eppendorfs que necessitareu.

3. Pipetejar 1 mL de reactiu R1 a cada tub eppendorf.

4. Afegir 7µL de blanc o calibrador o mostra problema al tub eppendorf corresponent.

5. Barrejar i incubar exactament 2 minuts després d'haver afegit la mostra o calibrador o blanc.

6. Transferir el contingut dels tubs eppendorf en una cubeta d’espectrofotòmetre i mesurar l’absorbància amb l’espectrofotòmetre.

7. Ajustar l’aparell a una longitud d'ona de 540 nm i el pas de llum de la cubeta d' 1 cm. IMPORTANT! Primer fer la lectura del blanc per ajustar l’espectrofotòmetre i a continuació mesurar les dilucions calibradores i la mostra problema. Fixa’t en l’ordre!!

Per fer la lectura utilitzarem dos cubetes:

• Una pel blanc i les dilucions de menys a més concentració.

• Una cubeta per llegir la mostra.

PREGUNTES E INTERPRETACIÓ DELS RESULTATS:

1. . Una vegada realitzada la corba de calibració contesta les següents preguntes:

• Si uneixes els punts representats, quin aspecte té el gràfic obtingut?

Te un aspecte lineal ascendent, les mostres amb major concentració tenen major absorbància i es van representant de manera lineal.

• Hi ha algun punt que es desmarqui? Què cal fer en aquests casos? Per què pot haver passat això?

Potser hi ha algún punt que es desmarqui per errors de pipeteig, si es un cas molt extrem que ens desvia la corba y sabem que hem tingut algún error visible (queda menys liquid total en comparació amb els altres, has posat el reactiu a temps diferents en els diferents eppendorf etc). L'error humà sempre es troba present en aquest tipus de pipeteig. En el nostre cas, hi havia un punt molt per fora de la recta així que el vas desestimar i vam fer una de nova.

• Quin tipus de gràfic has obtingut? Quin tipus de relació observes entre la concentració del calibrador i l’absorbància

A mesura que augmenta la concentració de les mostres del calibrador, augmenta la absorbància.

• Per què ens serveix aquest gràfic?

Conegut com un gràfic anomenat de recta patró, a partir d'aquest es pot extrapolar a quina concentració tens la teva mostra si saps la seva absorbància. ´

2. . Quina concentració d’IgG té la mostra problema? Creus que l’has pogut determinar satisfactòriament?

La mostra problema segons el nostres resultats i la nostra corba patró ens dona una concentració de 371,7 (mg/dL). Com hem pogut determinar on era l'error de la corba de patró i que només era en un tub considerem que la concentració obtinguda es més o menys correcte i s'apropa al valor real.

3. Si la mostra t'hagués donat una concentració de 1100 mg/dL l'hauries pres com a resultat definitiu? Què hauries fet?

Hauria de augmentar les concentracions del calibrador per poder incloure el rang , ja que es troba molt a fora del màxim de concentracions conegudes que es 798 mg/dL. Hauriem de fer una corba patró amb concentracions superiors del patró per poder extrapolar l'absorbància correctament.

Primera corba patró, on hi ha un valor molt fora de la serie. sedurament degut a un erorr de pipeteig. La R de la corba es inferior a 0,995 i vam decidir fer una nova eliminat el valor allunyat.

En aquesta pràctica durem a terme un test ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) per detectar la presència d’anticossos en sang i determinar si un pacient ha estat exposat a un agent infecciós, com poden ser bacteris, virus i fongs (antígens). Si el pacient ha estat exposat, el cos desencadena una resposta immunitària i en pocs dies milions d'anticossos que reconeixen l'antigen s'hi uneixen i circulen pel torrent sanguini. Aquests anticossos assenyalen les cèl·lules portadores d'aquests antígens com a invasors, i els condueixen a la seva destrucció per l'acció d'altres cèl·lules del sistema immune.

Concretament, simularem1 la detecció d'anticossos anti-VIH (contra el virus del VIH) ensèrums de pacients.

Per fer-ho, realitzarem una técnica d'unió primària qualitativa, una ELISA INDIRECTE. Consisteix en fixar en la placa un anticós contra l'antigen a determinar (en aquest cas l'antigen es un anticós), i si la mostra conté anticosos anti-VIH, posar un segon anticós secundari contra el primari unit a un enzim que doni una reacció colorimétrica.

Reactius: cadascun guardat en un eppendorf amb un codi de color:

• Proteines viriques purificades (antigen VIH)

• Serum dels pacients a determinar [Ac-Anti-VIH]

• Anticòs secundari anti-igG humana conjugada a HRP.

• Control positiu: serum pacient amb anticossos anti-VIH

• Control negatiu: serum pacient sense anticossos anti-VIH

• Substrat del HRP (TMB)

• 10x PBS

• Tween 20

• Tires de 12 micropouets

• Micropipetes i puntes

• Marcador

Prepació dels reactius: en primer lloc hem de calcular 5mL de Wash buffer. Ha de tenir PBS 1x i Tween 20 al 0,5%.

• Tween= 0,025 mL --> 25 ul

• PBS = 0,5 mL --> 500 ul

Procediment:

Hem d'analitzar dues mostres problemes (M1 i M2) juntament amb un control positiu i control negatiu.

1. Rotular la part externa dels pouets. Ferem triplicats, posarem 3 pous del control +, 3 del -, 3 de la mostra 1 y 3 de la mostra 2.

2. Transferir 50ul de l'antigen del tub verd a cadascun dels 9 pouets que farem servir. Esperar 10 minuts mentre que l'antigen s'uneix al fons dels pouets (absorció).

3. Rentar amb Wash Buffer: volcar la tira dels micropouets sobre el paper absorbent, donar uns cops petits damunt i omplir amb una pipeta descartable el wash buffer a tots els pouets SENSE esquitxar els pous del costat i evitar tocar el fons perque no hi hagi contaminació creuada entre els pouets.

4. Transferir 50ul del control (+) als pous dels tres pouets amb una punta nova de pipeta.

5. Transferir 50ul del control (-) als pous corresponents amb una punta nova.

6. Transferir 50ul del serum del pacients M1 als pous marcats amb una punta nova.

7. Transferir 50ul del serum M2 als pous corresponents amb una punta nova.

8. Esperar 10 minuts per permetre que els anticcos presents en el sèrum de les mostres que s'uneixin a l'antigen.

9. Rentar

10. Posar 50ul de l'anticós secundari a cadascun dels 12 pouets.

11. Transferir 50ul del substrat marró a cadascun dels 12 pous.

12. Esperar 5 minuts i anotar el resultat.

L'anticòs secundari està conjugat a un enzim (HRP) que provoca la reacció a partir d'un substrat incolor i l'obtenció d'un producte blau. Abans d'avançar, farem una previsió dels resultats:

• De color blau: Els pous de control positiu, si les mostres M2 i M2 contenen antigen (Ac Anti-VIH) també.

• Incolor: Els pous de control negatiu i si les mostres M1 o M2 no contenen antigen (Ac Anti-VIH), també incolores.

PREGUNTES I INTERPRETACIÓ:

1. Què observes en els diferents pouets? Com ho interpretes? Què en pots dir de les mostres problema, les consideres positives o negatives?

En el nostre cas, les mostres M1 i M2 eren positives, es a dir, VIH-positives, el control també era positiu i el control negatiu va sortir incolor, pel que la prova estaba ben realitzada i controlada.

2. Fixa’t en el procediment seguit a la pràctica. Hi ha un pas molt important del protocol de l’ELISA que no hem realitzat. Quin és? Quina conseqüència pot tenir això en els teus resultats? Creus que seria important incloure’l? En quin punt ho faries?

En cap moment hem parat la nostra reacció, pel que si deixem passar el temps, al final els pous seguiran adquirint coloració blava i potser podriem confondre els resultats negatius amb positius.

3. Per què hem repetit tres cops l’anàlisi de cada mostra? Quina utilitat té això?

Per confirmar que has realitzat la técnica inmunològica correctament. Ens permet saber si hem posat bé tots els anticossos i rentat bé entre els passos, que no hem contaminat els pous, etc.

4. En aquest cas clínic, es poden obtenir resultats positius de pacients que encara no manifesten la malaltia. Per què passa això? Com s'han d'interpretar els resultats i com s'hauria d'actuar?

Pot ser un pacient seropositiu, es a dir, el virus es troba de forma latent al seu cos i per això presenta anticossos anti-VIH, pero no presenta la malaltia amb els seus sintomes, la SIDA. S'haurà d'avisar al metge per a que comuniqui el resultat al pacient i començar un tractament contra el virus i que se li inclogui en les proves de serovigilància.