MP2 Tècniques Potenciomètriques i de separació de substàncies

L'objectiu de la pràctica es familiaritzar-se amb el material i els aparells del laboratori i la seva ubicació.

Tipus de material que trobem al laboratori:

Al laboratori podem trobar material de vidre, de plàstic, de porcellana o metall. Aquest es pot diferenciar segons la seva reposició, es a dir, si es fungible (que es pot trencar) i aquí trobem material descartable com les pipetes pasteur de plàstic o reutilitzable, com les provetes. Els aparells que podem trobar al laboratori i ocupen un espai fix es classifiquen com a inventariable. En el nostre laboratori trobem les centrífuges, estufes, campanes laminars, nevera, autoclau...

També diferenciem si el material es volumètric (serveix per a fer mesures exactes). I aqui es on es troben classificades les: pipetes graduades, aforades, matràs aforat, provetes, etc...

Com a material no volumètric tenim els vassos de precipitats, erlenmeyer, tub d'assaig, gradetes, etc...

Distribució:

A la imatge podem obsevar com es troba distribuit el Laboratori 209 de l'Institut Bonanova. Els números indiquen els armaris i aquets es poden diferenciar per àrees, com els armaris de microbiologia (11-12). O la de biologia molecular (66-64).

També podem trobar els armaris distribuits per si el material que hi ha dins son reactius sòlids, liquids, material de vidre, diferents tipus de matrassos, vassos de precipitats, etc. Hi ha, per exemple, un armari os es guarden els guants, uns altres on hi ha totes les micropipetes o els flascons i eppendorfs.

Es important organitzar el laboratori segons les necessitats del grup. En el nostre cas es tracta de un laboratori de pràctiques, pel que tot té un sentit funcional. Si et trobes fent una pràctica de micro, tens el material i reactius necessaris en aquella àrea i no t'hauràs de desplaçar per anar buscant cadascun dels materials. També es troba el material volumètric de vidre en una zona, per a que quan l'alumnat necessiti agafar més d'un vagi a aquella zona. També es troben els armaris on es guarden els materials que es reponen, com els guants, les puntes de micropipeta, etc.

Tots els armaris es troben identificats amb un número i també en alguns hi ha etiquetes que posen per fora el que hi ha dins, per identificar de forma ràpida l'armari on has d'anar per a buscar el teu material i reactius per a la pràctica.

Els reactius:

Hi ha varis armaris, tenim els que es troben en els armaris de solid, sec, reactius de sodi, de-.....

L'objectiu de la pràctica es aprendre a utilitzar el material volumètric bàsic del laboratori.

El material volumètric serveix per a fer mesures exactes, es un material que pot ser graduat o aforat i es troba calibrat. No es pot utilitzat per escalfar ni omplir amb liquids calents. L'utilitzem quan volem una quantitat exacte de liquid, ja sigui per contenir-lo o abocar-lo.

• Pipeta aforada o graduada

• Matràs aforat

• Proveta

• Bureta

El no-volumètric serveix per fer mesures aproximades. L'utilitzem per escalfar liquids, dissoldre components o prepara dissolucions.

• Erlenmeyer, per fer una bona dissolució amb aquest vas hauriem de posar una mica de aigua, el solut i després agitar i fer la dissolució i enrasar un cop estigui feta. Perque el solut ocupa un espai que també conta per l'enrasament.

• Vas de precipitats

• Material de suport: gradetes, pinçes..

• Tub d'assaig

Limits d'incertesa o exactitud:

Indiquen a quan s'aproxima el valor de la medició al valor real, es a dir, els limits ens indiquen quina es la exactitud del material.

Als materials volumètrics tenim inscrit quina es la seva tolerància, es a dir, el limit d'error màxim que s'indica amb +/-.

A l'hora d'escollir un materials ens haurem de fixar quin es el seu limit, per exemple, la pipeta graduada de 5mL, tenia un limit d'incertesa major que la pipeta aforada de 25mL, per això, a l'hora de enrasar 25mL de liquid quedaba més exacte amb la pipeta aforada, ja que el seu error era de 0'5mL, en canvi el de la graduada era de quasi 1mL, i com haviem de fer-ho de 5mL en 5mL, anavem arrosegant aquest error de mesura.

Ens haurem de fixar sempre en el limit d'incertesa a l'hora d'escollir el material i d'enrasar.

Per enrasar vessarem el liquid sense arribar a la linia d'aforatment i després situar els notres ulls a l'alçada de la linia, i afegir, gota a gota el liquid que falti fins que la base de la curvatura del menisc quedi exactament sobre la linia gravada de l'instrument.

Imatge: diferents materials del laboratori:

Erlenmeyer 250mL, matràs aforat de 250mL, proveta de 100mL, vas de precipitats de 200mL, pipeta aforada de 25mL

En aquesta pràctica vam apendre a utilitzar les micropipetes Gilson y Finnpipete.

Aquests son els dos tipus de pipetes que hi ha al laboratori, també podem trobar altres de diferentes cases comercials, però les més utilitzades son aquests dos models.

Puntes de micropipeta:

Les micropipetes es diferencien segons el volum que poden recollir i en funció d'aquests poden tenir un codi de colors i cadascuna va amb una punta determinada. Hi ha tres tipus de puntes:

• Blanques: les més petites, per a pipetes de 2ul i 10ul.

• grogues: de mida mitjana, per a pipetes de 100ul i 200 ul.

• Blaves: de mida gran, per a pipetes de 1000ul.

Segons la marca comercial de la pipeta, podem indicar el volum de diferent manera:

• PIPETES GILSON:

S'indica el volum i el sentir de la lectura es en forma vertical i hi ha 3 espais amb el que ho podem fer. Segons la pipeta y el volum posarem decimals i centesimes.

P2: de 0'2 a 2 ul. El volum mínim s'indica 002 de manera vertical i el volum máxim 200. En el cas de utilitzar, per exemple, un volum amb decimals, com 1'24ul, posariem 124 de manera vertical.

P20: de 2 a 20 ul. El volum mínim s'indica 020 i el màxim 200. En aquest cas l'últim número serien decimals i a la pipeta es troba indicat de color vermell.

P1000: de 200 a 1000ul, el volum mímin es 020 i el màxim 100. En el cas de un volum com 326 hauriem de posar 032 i amb les ralletes de la pipeta ajustar les centesimes.

• PIPETES FINNPIPETTE:

En aquestes pipetes el volum i la lectura dels dígits es horitzontal. També hi ha 3 espais per posar-ho.

P20: volum mínim 020 i volum mázim 200.

P200: volum mínim 020 i volum máxim 200.

P1000: volum mínim 0200 i volum máxim 1000, en aquest cas aquesta pipeta conté els 4 números.

Un bon funcionament de la pipeta es important perque els volums siguin el més exactes possibles, ja que estem treballant amb volums molt petits.

Per pipetejar bé s'ha d'agafar la pipeta correctament, agafant-la pel mánec i que quedi recolzat el colze sobre l'ejector. Les pipetes tenen un émbol que consta de 2 topes. Per agafar un volum cal prémer fins al primer, introduir la pipeta en el volum que vols recollir i acompanyar l'émbol cap amunt. Així contens el volum que vols transpassar, per ejectar-lo, cal tornar a prémer l'émbol fins al primer tope, i si queda volum a la pipeta, pots apretar fins al segon tope per a que sorti tot el volum.

Un cop has acabat de posar els volums les pipetes compten amb un ejector que tirará la punta quan l'apretis i així no la toques amb la mà i la pots tirar directament al contenidor de bioseguretat groc, que es troba a la poyata.

Imatge: pipetes Gilson amb les puntes que s'utilitzen per a cadascuna. Es pot veure el codi de colors de cada volum. A darrera, les puntes i el contenidor.

Un banc de dilucions es una sequència de dilucions en la que es disminueix la seva concentració de forma progressiva. Serveixen per tenir diferents concentracions seriades de una dissolució mare.

Tenen diferents aplicacions, com preparar plaques de titulació per a experimens de immunologia, on necessites saber quin es el títol d'anticossos en el que hi ha una seroconversió. O en el camp de la microbiologia, on fas diferents dilucions per sembrar a diferents plaques i comptar bacteris.

Per preparar un banc de dilucions, hem de tenir en compte si volem fixar el volum final o els volums intermedis. Es a dir, podries necessitar que al final, l'últim tub necessitis tenir 1ml, per exemple, o que necessitis 350 ul als tubs intermedis. Per fer els cálculs t'has de fixar en el factor de dilució, aquest es el que es repeteix i el que es traspassa de tub en tub. El factor s'obté dividint el volum de la concentració de dissolució entre el volum final (volum del dissolvent + volum del concentrat).

El factor de dilució es repeteix continuament respecte al tub anterior, però la dilució es va multiplicant respecte a la concentració inicial a mesura que anem fent dissolucions:

Si a cada traspàs es fa una dissolució 1/2 i tenim 4 eppendorf, aquest té una dilució 1/8 respecte al primer (1/2x1/2x1/2x1/2).

En el cas de volum final fixe:

Segons el factor de dilució, en el cas 1, 1/10. Hauràs de posar 900 ul de dissolvent a cada tub i 100ul de la dissolució al tub 1, d'aquest mateix tub, després de resuspendre, pasaràs 100 ul al tub 3, quedant així al primer tub 900 ul. Així continuament fins tenir la teva sèrie.

En el cas 2, la dilució es 1/2, es a dir, la meitat, pel que si el volum es de 700 ul, hauràs de posar a cada tub 350 de dissolvent i al primer tub 350 ul de la dissolució concentrada i d'aquest passaràs 350 ul al següent tub, quedant 350ul. Així farás fins a 4 eppendorfs per completar la sèrie.

En el cas de volum intermedi fixe:

Si necessites, com en el cas 3, un volum intermedi de 700ul amb un factor de dilució de 1/2, hauràs de posar 700ul de dissolvent a cada tub + 700 ul de dissolució concentrada al primer. D'aquest primer treuràs 700 ul i el passaràs al segon tub, resuspendrem i passarem 700ul al tercer i així quan arribem a l'ultim tub tindrem 1400 ul (1'4mL).

Per fer un banc de dilucions s'han de tenir en compte varis aspectes tècnics:

• S'han de rotular tots els eppendorfs a utilitzar segons l'ordre i la sèrie que hagis de fer.

• Preparar tot el material, puntes, pipetes adequades, vas de precipitats amb el dissolvent, la dissolució concentrada, etc.

• Per fer una dissolució, si no hi ha canvi de reactius, no cal fer un canvi de punta cada cop que passes de tub, perquè vas de una solució més concentrada a menys, i així pots resuspendre i passar el volum de un a l'altre sense cambiar la punta.

• Cal fer els càlculs previs i preparar una taula per a tenir clar quin volum de dissolvent i de dissolució cal posar a cada tub.

Objectiu:

• Saber com funciona el pH-metre i com determina el pH.

• Aprendre a calibrar i utilitzar correctament el Ph-metre per mesurar el Ph de les solucions al laboratori.

El pH-metre es un instrument de mesura que mesura el pH a partir de les concentracions de protons (H+) de les solucions. Consta de un parell de electrodes submergits en la dissolució que volem determinar el pH.

Abans de començar a fer servir el pH-metre hem de calibrarlo, ja que ens hem d'assegurar que la mesura que dona la lectura s'assembla el més possible a una solució de la qual sabem el seu pH de manera exacta, utilitzem un calibrador de pH=4 (àcid) i un altre de pH=7 (neutre). Així posem la màquina a punt per a poder determinar el pH de una dissolució problema. Hem de fer aquest porcés per compensar les desviacions del potencial que l'electrode experimenta amb el temps.

Hem de utilitzar el pH de 7 perque posa els mV sota un valor "0" i amb el de ph=4 farem uns -mV que serviràn al ph-metre per a fer una regressió lineal per poder calcular a quins mV es troben les mostres que analitzi després.

Per poder determinar le pH de uns dissolució ho podem fer amb el ph-metre o amb tires reactives, aquestes funcionen dintre de un rang i et donen un resultat orientatiu sobre el pH de la teva dissolució. Pel que si volem saber quin es el rang de manera més precisa, utilitzarem el ph-metre, que dona un resultat més exacte. Serviria per aquelles dissolucions de les quals volem mantenir el pH sempre concret, com per a fer EDTA que ha de tenir un pH=8 per dissoldre's.

Per fer una bona mesura amb el pH-metre hem de saber mantenir en bones condicions la màquina, per això:

• Hem de mantenir sempre humid l'electrode.

• Cada cop que el treiem del seu recipient, hem de netejar-lo amb aigua destil·lada i utilitzar un paper absorbent per assecar-lo abans de fer una nova determinació.

• Calibrar-lo cada vegada que es necessiti i mantenir les solucions calibradores en bon estat amb la data de caducitat apuntada i renovar-los si es necessari.

Mantenir el pH de les dissolucions de laboratori es important perque algunes determinacions depenen exclusivament que es mantingui el pH, com podria ser el cas de fer un buffer de un gel de electroforesis, el buffer de un cultiu cel·lular, on les cel·lules poden morir si el medi es àcid.

El TAE és una solució que s’utilitza al laboratori per fer una electroforesi en gel d’agarosa i separar fragments de DNA. És ideal sobretot per separar fragments grans (>1000 pb). Es pot reciclar però no per a més de 3 electroforesis perquè l’aigua s'evapora i incrementa la concentració iònica. Per aquest motiu, en general en els laboratoris es sol tenir preparada una solució 10 vegades concentrada (10x) i en el moment de l’electroforesi es fa una dilució per tenirla a una concentració 1x.

En aquesta pràctica prepararem TAE 10x per tal de poder utilitzar-lo en la pràctica següent.

EL TAE es compost per:

• Tris pH 7,4 0,4M

• Àcid acètic glacial 0,2 M

• EDTA pH 8.0 0,01M

El nostre grup es va encarregar de preparar l'EDTA, per fer-ho varem necessitar 9,306g de EDTA per a preparar un volum final del 100 mL a 0,5M, aquesta solució només es dilueix a un pH constant de 8, pel que haviem de muntar el pH-metre a sobre de la agitadora magnetica a on teniem el vas de precipitats amb la mosca i la solució, varem posar uns 20mL d'aigua destil·lada i anavem ajustant el pH a 8 cada vegada amb NaOH perque a mesura que s'anava dissolent el pH anava baixant. Varem haver d'anant posant aigua perque va costar molt que la sal es dissoles, però eventualment es varen dissoldre la majoria de trossets de sal i ens va quedar una dissolució transparent. Després, per acabar, haviem de enrasar en un matrás aforat de 100mL amb aigua destil·lada per guardar-ho en una ampolla pirex.

Quan tots els grups vam acabar de prepara el nostre reactiu pel TAE, varem posar-ho tot en un vas de precipitats gran i vam possar els mL necessatis per a preparar 600mL de TAE 10x. Quan ja els teniem vam enrasar amb aigua destil·lada i varem remanar el vas de precipitats tapant-lo amb parafilm.

Preguntes reflexió:

Quan preparem dissolucions al laboratori hem de ajustar el pH en el moment que aquesta s'está dissolent, es a dir, quan l'estem agitant, perquè es en aquell moment quan estan canviant constantment les concentracions de protons de la dissolució, i quan ja estigui tota dissolta podrem ajustar el pH abans d'enrasar amb aigua destil·lada per assegurar-nos que le pH es el correcte.

En un laboratori gran, normalment, els reactius els compren per a poder fer els protocols més ràpids, però això no sempre es possible, depent del pressupost que tingui el grup, de si una técnica es molt específica i pot ser es fa poques vegades, pel que a vegades et surt més a compte preparar-la abans amb el que ja tens al laboratori, etc. El que és clar que tot personal tècnic de laboratori ha de saber preparar reactius i utilitzar el material volumétric bàsic i aparells per aquests.