En aquesta primera pràctica vam apendre a realitzar blocs de parafina.

Material: Pinces, guants, estació de treball amb dispensador de parafina, placa freda, motllos, cassetes, mostres fixades, caixa per a guardar el blocs.

Procediment:

- S’agafa un motllo metal·lic de la mida adient i es col·loca una mica de parafina. A continuació s’hi posa la mostra en l’orientació correcte, es fa una lleugera pressió per a que contacti sobre el fons del motllo i es posa un moment a la placa freda. Seguidament es treu de la placa freda i amb el dispensador de parafina s’omple amb parafina. Es col·loca la base del cassette sense tapa a sobre i s’hi torna a afegir parafina. De El motllo+cassette es deixa sobre la placa freda.

- Un cop fred el bloc, es desemmotlla fent pressió per un costat, entre la parafina i el motllo. S’han d’eliminar les restes de parafina que hi ha a les parets del cassette. El blocs es guarden endreçadament en la caixa de cartró.

Punts clau:

• Escollir un bloc de metall adient per la mida de la mostra.

• Omplir amb una mica de parafina el bloc i passar a la placa freda.

• Tocar totes les parts de la mostra i engarxar-ho al bloc uniformement en la placa freda. Pensar en com orientar la mostra abans de aquest pas.

• Ser ràpid en passar de la placa freda a omplir la resta de bloc amb parafina SENSE tornar a posar el bloc a la placa calenta.

• No oblidar-se de posar la base del cassete abans de omplir amb la parafina.

• Identificar la mostra amb llàpis a la base del cassete.

• Posar el motlle + cassete a la placa freda perque es solifidiqui la parafina i aconseguir el bloc.

• Retirar la parafina solidificada de la placa freda perque sino es pot quedar enganxat el motlle de metall i artefactuariem el bloc.

• Retirar la parafina del bloc un cop desmotllat amb un ganivet.

Per posar un programa de 1 minut per cada cistella:

Prog > (+ - minuts ) > enter i repetir als 12 programes:

(PROG > MINUT > ENTER > PROG > MINUT >ENTER... )

Les cistelles es coloquen a la maquina amb els cassetes a incloir. Un cop hem introduit la cistella li domen a auto start.

Per saber si la máquina funciona ens ho indica un llum verd del processador i perque fa soroll.

Per parar el programa li domen a MANUAL STOP.

Si volem que el processador començi un diumenge a les 17:30 si avui sigués un divendres a les 16:00h:

1. Colocar CLOCK a les 16h.

2. DAYS DELAY (2 vegades). Va cada 24h. Divendres-dissabte-diumenge (2 dies).

3. DELAY ON (llum groga encesa del mateix botó que ens indica que el programa està per començar tard).

4. START TIME: posar a les 17:30h

5. AUTOSTART. El processador començarà a treballar el diumenje a les 4 de la tarda.

Objectiu de la pràctica: Aprendre a utilitzar el micròtom Minot o de rotació i a recuperar el tall sobre el portaobjectes.

Procediment:

1- Omple d’aigua de l’aixeta el bany de flotació fins a uns 2cm per sota del marge i posa en marxa el bany a 45ºC.

2- Llegeix atentament les instruccions del micròtom Minot.

3- Agafa un bloc de parafina que prèviament hem posat a refredar a la nevera que només conté parafina i fes el talls seguint les instruccions del manual. Fes talls de diferent gruix.

4- Posa talls sobre bany de flotació i pesca’ls amb un portaobjecte.

5- Agafa blocs amb diferents teixits i tallal's a 6 micres i a 4 micres.

Per fer el tall:

1. Encendre el microtom i el bany calent (previament per tenir-lo a una temperatura de 40 graus celcius)

2. Posar a refredar el bloc de parafina a la placa freda

3. Preparar els estris, com les pinces, les brotxes i portaobjectes i posar la fulla de tallar al portafulles.

4. Posar el bloc al portablocs i orientar-lo.

5. Apropar la fulla el máxim movent tot el portafulles i acotar el més pròxim posible per començar a desvastar.

6. Desvastar a 20 micres.

7. Seleccionar la mida del tall (10,6, 2 micres) i fer seccions. Per agafar el tall es bufa per mantenir-lo el més estirat posible, amb un moviment lent però sense parar-se a meitad del bloc per no fer ratlles amb la fulla.

8. Un cop agafem el tall portar-lo al bany i estendre'l.

9. Agafar el portaobjectes i pescar el tall posant el portaobjectes de forma vertical i agafant el tall o sèrie d'interés.

10. Colocar el portaobjectes a un placa calenta per fixar el tall.

Video demostració: https://www.youtube.com/watch?v=duKTFcoylFc

El procés de tinció d'un tall histologic requereix de una serie de processos. Com el tall conté parafina, primer hem de desparafirnar-lo i hidratar-lo, perque les tincions son solubles en aigua.

Desparafinar i hidratar:

1. Xilol, com al laboratori es un producte tóxic, utilitzem el Neoclear 10 min, que es un substitut, sota la campana i utilitzant guants.

2. Repetir el Neoclear 10min.

3. 1 min a la cubeta de 100% etanol (x2).

4. 1 min a la cubeta de 96% etanol (x2).

5. 1 min a la cubeta de 70% etanol (x2)

6. 1 min a la cubeta de 50% etanol.

7. 2 min en aigua.

El procés de hidratació es fa en banys decreixents amb alcohol.

Els portaobjectes amb els talls es van passant de cubeta en cubeta amb una cestilla i per controlar el temps amb els timers que hi ha al laboratori. Hem d'utilitzar un paper absorbent per anar movent la cestilla amb els portaobjectes.

Un cop ja tenim la mostra hidratada procedim a tenyir amb H-E:

S'incuba els portaobjectes en unes cestilles amb els diferents colorants:

1. Hematoxilina de Mayer 6 min.

2. Rentar amb aigua de la aixeta corrent. Aquesta ha d'estar oberta i ha d'anar tirant aigua. Podem observar que quan posses en aquesta cubeta les mostres agafen una coloració més blava.

3. 20 segons en Eosina.

4. Rentat amb aigua destil·lada 2 min.

Quan ja tenim la tinció feta hem de procedir a deshidratar un altre cop ja que el medi de muntatge no es miscible amb aigüa.

1. 1 min en aigua.

2. 1 min en 50% etanol.

3. 1 min en etanol 70% (x2)

4. 1 min en etanol 96% (x2)

5. 1 min en etanol 100% (x2)

6. 1 min en neoclear (x2). Aquestes cubetes han de ser diferents a les cubetes en neoclear del procés de desparafinar, ja que quedarien restes i no es podrien utilitzar per muntar.

El procés de deshidratació es fa en banys creixents de alcohol.

MUNTATGE:

Quan ja tenim els portaobjectes en l'últim bany amb neoclear les hem de mantenir humides per procedir a muntar, es posen 2-3 gotes del medi de muntatge i es deixa anar un cubreobjectes a sobre amb una mica de pressió al mig.

En aquesta pràctica vam tenyir talls de intestí amb blau alcià i cec amb blau de toluidina.

El procés per tenyir aquestes mostres, que estaven incloses en parafina, es el mateix que per a la tinció anterior, primer hem de desparafinar, perque les tincions no son compatibles amb la parafina, per aixó posarem els portes en una cubeta, les posarem en la tira de desparafinació, que son concentracions decreixents de alcohol, per aconseguir hidratar la mostra i procedir a la tinció:

1) Neoclear: 10 min

2) Neoclear 10 min

3) 100% ETOH: 1 min

4) 100% ETOH: 1 min

5) 96% ETOH: 1 min

6) 96% ETOH: 1 min

7) 70% ETOH: 1 min

8) 70% ETOH: 1 min

9) 50% ETOH: 1 min

10) dH2O: 2 min

Tinció amb blau alcià:

Quan ja tenim els talls de intestí hidratats, procedim a tenyir, hem de preparar les cubetes amb els colorants necessaris: blau alcià, aigüa destil·lada, aigüa de l'aixeta i l'hematoxilina de mayer sota la campana de gasos.

1. Blau alcià - 5 min

2. Aixeta - 3 min

3. destil·lada - 30 segons

4. Hematoxilian de Mayer - 6 min

5. Aigua de l'aixeta - 10 min. En aquest pas podem observar com els talls viren de un color lilòs a blau.

6. Rentar amb aigua destil·lada - 2 min

Mentre estaven els talls en aigua corrent 10 minuts vam aprofitar per fer la tinció de Blau de toluidina del tall de cec.

En la mateixa poyata, preparem dos cubetes, una amb blau de toloidina i una altre amb aigua destil·lada.

1. Blau de toloidina - 2 min

2. Aigua destil·lada - 2 min

Quan ja tenim els nostres tres talls tenyits, hem de procedir a deshidratar perque le medi de muntatge DPX no es miscible amb aigüa, pel que hem de tornar els tres talls a la tira de deshitratació, que consta de concentracions creixents d'alcohol.

1) dH2O: 1 min

2) 50% ETOH: 1 min

3) 70% ETOH 1 min

4) 70% ETOH: 1 min

5) 96% ETOH: 1 min

6) 96% ETOH: 1 min

7) 100% ETOH: 1 min

8) 100% ETOH: 1 min

9) Neoclear: 1 min

10) Neoclear: 1 min

Per muntar farem el mateix procediment que la tinció anterior:

1. En els talls humits, posarem unes gotes de DPX amb una pipeta pasteur.

2. Agafem un cubreobjectes i el deixem anar amb una mica de curvatura per no fer bombolles en el tall.

3. Deixem assecar.

Fig 1. Corte observado con el microscopio de 10x, podemos ver una sección del tejido, parace bastante normal, hay zonas donde hay inflamación notoria.

Fig2. Corte a 10x, se ven muchas zonas con más presencia de nucleos amontonados.

Fig 3. Corte visto a 40x, poca definición del citoplasma, nucleos muy azules y estructura del pulmón correcta.

Fig 4. Corte a 40x, Zona con grosor inadecuado + inflamación.

Fig 5. Visto a 10x. Presencia de una arrugar muy grande en todo el campo de visión.

Fig 6. Aumento de la arruga a 40x.

Fig 7. Más arrugas en el corte a 40x.

Fig 8. Zona de un corte con grosor inadecuado a 40x.

Este colorante tiñe polisacáridos del tejido en una gama de azules a morados.

Fig1. Corte a 10x del intestino, vemos el epitelio simple del intestino y tejido conjuntivo laxo de un azulado menos intenso, se pueden intuir las secreciones de MP ácidos en azul celeste.

Fig 2. Corte a 40x de las vellosidades y criptas intestinales. Mucosidades en azul celeste.

Fig 3. Corte a 10x, mucho contraste, zonas muy intensas y vemos una arruga.

fig 4. corte a 10x, tres arrugas que atravaviesan todo el corte, debido a un mal corte y en esas zonas se ha engrosado.

Fig 5. Corte a 40x, vemos la arruga en aumento + engrosimiento del corte.

Fig 6 y 7. Arrugas en el corte, porque al hacer el montaje se ha quedado una burbuja de aire entre el portaobjetos y el cubre.

Es un colorante metacromàtico, da diferente coloración en una gama de azules a morados.

• Núcleos: azules

• Carbohidratos: azules

• Citoplasma, ARN: azul a verde brillante

Fig 1. Corte a 10x, estructura del ciego normal.

Fig 2. Corte a 10x, vemos un amontonamiento de nucleos en algunas zonas con mayor intensidad de color.

Fig 3. Aumento 40x, vemos tejido conectivo en azul muy grisáceso y estructuras de membrana en azul más inteno brillante, nucleos en azul púrpura muy amontonados.

Fig 4. Zona engrosada con un amontonamiento de núcleos que se ven casi difusos.

Fig 5. Parte de la membrana rota.