La trasformazione batterica

Che cos'è la trasformazione batterica? 

Si tratta di una delle fasi del clonaggio genico, ovvero il procedimento utilizzato per moltiplicare in serie esponenziale uno specifico gene. 

Complessivamente il clonaggio genico si divide in:

1. Isolamento/estrazione del gene di interesse tramite enzimi di restrizione e successiva separazione mediante elettroforesi su gel

2.  Inserimento del gene isolato in un vettore di clonaggio ( es plasmide) 

3. Trasformazione batterica, ovvero inserimento del plasmide ricombinante in E. coli

4. Moltiplicazione dell'organismo che contiene il gene

5. Individuazione delle cellule batteriche trasformate mediante una  sonda genica. Nel nostro esperimento la sonda genica è il gene della medusa che codifica per la proteina GFP che rende verdi fluorescenti i batteri trasformati se illuminati con luce ultravioletta.

Ma come siamo arrivati a tutto questo? Ricostruiamo tutte le tappe di questo processo

Premesse:

1. La scelta di utilizzare il batterio E. Coli è dovuta al fatto che è un organismo non patogeno con tempi di riproduzione per scissione binaria,  molto veloci (ogni 20 minuti), si coltiva facilmente (la sua temperatura di crescita è sui 37 °C) e ha una parete cellulare abbastanza sottile (è infatti un batterio Gram negativo), il che rende facile alterare l'integrità.

2. Il gene che codifica la proteina GFP ( Green Fluorescent Proptein) viene inserito all'interno del batterio attraverso il plasmide pGLO, formato da un DNA circolare (circa 5000 paia di basi), che si distingue dal materiale genetico principale del batterio per le ridotte dimensioni. 

3.  All'interno del plasmide pGLO sono inseriti: 

• Amp R: il gene che conferisce la resistenza all'ampicillina; 

• Ara C: gene regolatore dell’operone arabinosio che codifica la proteina regolatrice dell'operone arabinosio (responsabili dell'espressione genetica della proteina GFP). Infatti la proteina codificata da questo gene regolatore agisce come repressore e si lega al promotore dell’operone arabinosio. Come nell’operone LAC è necessario il lattosio per sbloccare il repressore così per l’operone ARABINOSIO è necessario lo zucchero arabinosio. Una volta sbloccato l’operone arabinosio potrà  avvenire anche la traduzione del gene GFP della medusa che conferisce colore verde fluorescente

• MSC: ovvero siti multipli di clonaggio che vengono riconosciuti da molti enzimi di restrizione (nel nostro caso EcoRI);

• ORI: origine di duplicazione (consente la duplicazione del plasmide all'interno della cellula).

Procedimento :

1. rendere i batteri competenti ovvero capaci di far entrare il DNA estrane attraverso elettroporazione ( mediante scariche ad alto voltaggio) oppure mediante trattamento con CaCl2

Il Cloruro di calcio permette, tramite la carica positiva dello ione calcio, di neutralizzare la carica negativa presente sulla superficie esterna del batterio, in questo modo il DNA plasmidico, carico negativamente per la presenza dei gruppi fosfato, potrà entrare. Infine lo shock termico ( 0 ° C, poi 42 ° C per 90 secondi e infine di nuovo 0° C) consente al plasmide pGLO di entrare in E. Coli (reso competente) 

2. Porre i batteri trasformati in un terreno liquido per 20 minuti (un ciclo di replicazione) a 37 ° C, per consentire loro di riprendere la replicazione

3. Seminare i batteri su piastra di Petri contenente terreno di coltura gelatinoso di agar agar. La piastra Petri è suddivisa in quattro settori, due indicati con segno meno e gli altri due con il segno più.

 Il significato di questi due segni è il seguente:

Il segno – indica che i batteri seminati non contengono il plasmide ricombinante 

Il segno+ indica che  i batteri seminati contengono il plasmide ricombinante

La semina avviene dunque con questo criterio:

• nel settore 1  LB/Amp - si pongono i batteri non ricombinanti privi del plasmide e nel terreno è presente l’antibiotico ampicillina

• nel settore 2 LB-si pongono i batteri non ricombinanti privi del plasmide e nel terreno non è presente ampicillina

• nel settore 3 LB/Amp + sono seminati i batteri ricombinanti con il plasmide pGLO ed è presente ampicillina

• nel settore 4 LB/Amp/Ara + sono seminati i batteri ricombinanti con il plasmide pGLO e nel terreno è presente sia ampicillina sia arabinosio responsabile dell’espressione del gene

4. Analizzare i risultati ottenuti dopo 24 ore di incubazione necessarie per consentire la replicazione batterica