微生物專題

一、微生物之發現及微生物發展

1.古代:利用微生物釀造醬油、麵包等發酵食品

2.雷文霍克:利用簡單的顯微鏡觀察酵母菌、紅血球、原生動物以及細菌

3.巴斯德:

(1)生命源自於生命的觀念

(2)確認酒精發酵與酵母的關係、殺菌問題等，並說明抗體在寄主內產生

二、什麼是微生物？

1.肉眼無法看見

2.五大類微生物:細菌(Bacteria)、原生動物(Protoza)、藻類(Algae)、病毒(Virus)、真菌(Fungi):酵母菌&黴菌

三、原核與真核細胞

1.根據細胞核結構而分類

2.差別:

(1)細胞大小

(2)核膜有無

(3)DNA構造

(4)細胞壁組成

四、微生物在分類學上之地位

Carl Woese將生物分為三域

1.Archaebacteria(太古生物)

2.Eubacteria(真細菌)

3.Eukaryotes(真核生物)

一、微生物的培養與分離技術

目的與原理

1.學習將細菌接種魚各種培養基上，並學會分離與純化細菌的方法

2.大量的微生物分布於各種各樣的自然環境。因此，我們可以利用基礎培養基將土壤的微生物分離出來進而觀察

(一)細菌之接種方法一所用培養基的種類不同，接種細菌的方法也不一樣若接種至固體培養基可利用劃線法(Streaking Method)與塗抹法(Spreading Method)。整個操作過程中，需要絕對的無菌，一般多在無菌台，接種環於使用前後必燒紅，才能達到滅菌效果；裝有菌液或培養基的容器打開後瓶口盡量要靠近酒精燈，以保持無菌狀態。

(二)細菌的分離:

(1)分區劃線法:將細菌菌落分散於plate中。

(2)混合菌液稀釋後，在均勻塗抹於plate中，可得單一菌落。

材料與設備

(一)菌種:大腸桿菌(E.coli)

(二)器材

1.接種環

2.酒精燈、70%酒精

3.三角波棒、燒杯

(三)試劑與培養基

1.95%酒精

2.37度培養箱

3.LB固體培養基、LB培養液

方法與步驟

(一)細菌之接種法

1.細菌懸浮法

(1)以接種環於母盤上取出大腸桿菌之單一菌落，置於培養液中。

(2)放至培養箱，隔天觀察細菌生長情形。

2.塗抹法

(1)以微量吸管取0.15 mL之大腸桿菌稀釋液，低於LB Plate上。

(2)利用三角玻棒將菌液均勻塗抹至培養基上

(3)菌盤倒放，置於培養箱培養

(二)細菌分離與培養分區劃分法

二、細菌生長的控制

目的與原理

本實驗在測定培養細菌時，外在的環境如何培養隻溫度、紫外光以及含氧量等，對細菌的生長是否會有影響。同時了解如何利用物理方法與化學藥劑，控制細菌生長。

材料與設備

(一)大腸桿菌

(二)設備

1.酒精燈

2.三角玻棒

3.37度培養箱

4.鑷子、圓形紙錠

5.化學物質:Kanamycin(10mg/ml)、蒜頭萃取液、漱口水、漂白水

6.無菌水

(三)試劑與培養基

1.LB plate*3盤

方法與步驟

(一)紫外光照射實驗

1.將大腸桿菌均勻塗抹於兩個LB plate上(塗抹法)

2.分蝶照射5分鐘與10分鐘紫外光，對照組為(實驗一)0分鐘對照組照射紫外光

3.倒放於培養箱，隔天觀察結果

(二)化學物質幹受性實驗

1.大腸桿菌之為稀釋菌液一管

2.以簽字筆在plate底下分別做標記代表不同化學藥劑

3.吸取0.1ml菌液，以三角玻棒塗抹於plate中

4.將鑷子過火，夾取4張指定放在塗好菌的plate上，分別加入0.015ml待測物以及無菌水

5.菌盤正放，至於培養箱隔夜培養後，觀察抗生素抑制細菌生長之情形

三、微生物的染色方法

目的與原理

微生物是無法用肉眼去看的，為了對微生物的構造及特性更加暸解，我們以染色處理來觀察微生物俊體的型態以及結構。

不同的染色法有不同的用意，用單一染料叫做簡單染色，是用來觀察細菌的基本外型。鑑定染色法則是可以用來為微生物分類。本實驗應用的染色方法為：簡單染色、負染色、及革蘭氏染色。

材料與設備

（一）菌種

1. 大腸桿菌 （E. coli）

2. 金黃葡萄糖球菌（S.A）

（二）設備

1. 戴玻片

2. 光學顯微鏡 、拭鏡紙

3. 接種環

4. 酒精燈

5. 鑷子

（三）試劑與培養基

1. 無菌蒸餾水

2. 95% 酒精

3. 鏡油

4. 2% Gram's 結晶紫染劑

5. Gram's Iodine

6. 0.5% 沙番紅 (Safranin)

方法與步驟

（一）熱固定法 （染色之前的步驟）

1. 滴 10 micrometer 的無菌水在玻片的中間，再用 tip 輕沾培養基上的 E. coli 菌落，然後跟玻片上的無菌水均勻混合

2. 用鑷子夾著塗抹後的玻片快速的在酒精燈上加熱2~3次，讓菌體固定在玻片上（白色的一層膜狀物）

（二）簡單染色 （Simple staining）

1. 使用固定法固定 E. coli 於玻片上

2. 使用 Crystal violet染劑滴 2~3 滴於玻片上 靜置 1 分鐘

3. 在染曹上用蒸餾水洗滌瓶將多餘的染劑沖掉（注意不要直接沖菌體）

4. 蓋上蓋玻片，用微生物微鏡觀察菌體的型態與顏色並拍照

5. 使用100X油鏡觀察

（三）負染色（Negative Staining）

1. 取一滴 Nigrosin (苯胺黑) 染劑於戴玻片邊緣

2. 使用 tip（或接種環）勾一點 E. coli 菌體置於染劑中均勻混合（不用熱固定）

3. 使用訂一片乾淨的玻片，將染劑與菌體混和液平推，使樣品由濃漸淡

4. 將蓋玻片覆蓋在較淡處，再使用顯微鏡觀察並拍照

（四）革蘭氏染色（Gram's staining）

1. 將 E. coli 及 S.A 熱固定於戴玻片上，平放在架子上。先以 2% Gram Crystal Violet 染劑滴於戴玻的菌體上，作用 1 分鐘，再以蒸餾水將剩餘的染料沖洗去除

2. 加入 Gram Iodine 媒染液（Mordant），作用 1 分鐘，用蒸餾水洗瓶沖洗

3. 再以 95% 酒精進行脫色作用。用手斜拿玻片，由上往下滴入 95% 酒精溶液（30 秒），直到流出的酒精變成無色

4. 加入第二種染液 Safranin（Counterstain），繼續作用 3 分鐘後，用水沖掉多餘的染料，以拭鏡紙吸去玻片上的水分，於顯微鏡下仔細觀察

5. 先以低倍鏡找含有菌體的位置，逐次增加放大倍數，最後加入一滴油鏡油，以 100 倍油鏡觀察，並畫圖紀錄細胞的外型與顏色