微生物學
前言
在這千變萬化的世界中，除了我們肉眼所見的動植物，更多的是在不同環境中生存的微生物。
在這兩天的課堂中，讓我們透過實驗、觀察和講解來探究這微生物的奧妙!!
實驗前提知識
- 細菌培植方法
細菌之培植方法與其所用之培養基密切相關:若是於固體培養基，可利用劃線法以及塗抹法；若為半固體培養基，則多為穿刺法。然不論採用何種方法，其皆有一核心要點:過程需絕對無菌以確認實驗不會受到雜菌汙染
- 細菌分離法
細菌的分離培養有以下方法:1.分區劃線法:藉由劃線以將細菌分散布於整個培養基上；2.稀釋塗抹法:將菌液稀釋以使菌液均勻塗抹後可出現單一菌落；3.倒皿法:將稀釋之菌液與培養基液混合直接冷卻成為培養基
- 細菌生長控制
細菌的生長大幅度受到環境影響，不過常見要點有以下:溫度，紫外光，含氧量，酸鹼，環境化學物質
- 微生物染色法
微生物染色法有以下兩種:簡單染色法及鑑別染色法。簡單染色法一是用於辨別細菌生死，二是觀察細菌基本外型；鑑別染色法主要用來分類微生物及觀察細胞上的構造
- 革蘭氏陰陽性菌
革蘭氏陽性菌細胞壁較厚，有外毒素，革蘭氏染色法染色後成藍黑色；革蘭氏陰性菌細胞壁較薄，有內毒素，革蘭氏染色法染色後成紅色
實驗目的
- 學會如何將細菌移植至培養基上生長，並將其分離以利觀察
- 觀察在外界狀態不同時細菌的生長狀態異同
- 將細菌染色以利觀察，並觀察其形態並判定其特性
實驗材料
- 大腸桿菌菌液（Escherichia coli，簡寫E. coli) 適量
- 金黃色葡萄球菌菌液(Staphylococcus aureus ) 適量
- 載玻片 4片
- 蓋玻片 3片
- 光學顯微鏡 2架
- 接種環 1支
- 酒精燈 1盞
- 聶子 1支
- 移液器 2支(200μm及20μm)
- Tip 適量
- 無菌水 適量
- 三角玻棒 1支
- 恆溫培養箱 1個
- 紙錠 5片
- Ampicillin 適量
- 蒜頭萃取液 適量
- 70%酒精 適量
- 95%酒精 適量
- 10%漂白水 適量
- LB 固態培養基 5盤
- LB培養液 1管
- 鏡油 適量
- 2%結晶紫染劑 適量
- 碘液 適量
- 0.5% Safranin 適量
- Nigrosin 適量
實驗方法
一.微生物的培養與分離技術
- 固態培養基
- 以移液器吸取0.1ml支E.coli菌液並滴於培養基上
- 若不需分離則以三角玻棒置於95%酒精中，取出過火併冷卻，將菌液以其均勻塗抹於培養基上
- 放入恆溫培養箱隔夜培養，即可使菌株生長
- 若需分離則是以滅菌接種環挑取大腸桿菌單一菌落,於培養基上沿平行線將菌落劃開,作為第一區
- 將接種環以酒精燒紅,殺死上面沾有之細菌,冷卻後再由劃過之第一區內,沾取少部分之菌落,將盤輕轉90度,亦以平行線劃開,此為第二區
- 重覆以上動作，劃出第三區，
- 放入恆溫培養箱隔夜培養，即可使菌株分離生長
- 培養液
- 以消毒殺菌過後之接種環刮取少許大腸桿菌
- 將接種環上之菌完全打入培養液中
- 放入恆溫培養箱隔夜培養，即可使菌株生長
塗抹法 劃線法
二.細菌生長的控制
- 紫外光照射賞験
- 準備大腸桿菌的稀釋菌液,並取兩個固態培養基
- 各取大腸桿菌液0.1ml,以塗抹法將其均勻分布於固態培養基之上
- 將均勻塗抹大腸桿菌之固態培養基,皆置於太陽光之紫外光下,並將蓋子打開
- 分別以紫外光照射5分鐘與20分鐘,並以上一實驗中塗抹法之培養皿作為受紫外光照射0秒之對照組
- 放入恆溫培養箱隔夜培養，隔日觀察並計算菌落數以推測紫外光對於細菌生長之影響
- 化學物質感受性實驗
- 取一裝有固體培養基之培養皿，於培養皿底部標示五個分散且分別表示無菌水，70%酒精，蒜頭萃取液，10%漂白水及Ampicillin之記號
- 取稀釋之大腸桿菌菌液，並以塗抹法均勻塗抹至培養基上
- 將聶子過火消毒，將五個指定至於培陽基底部標是處正上方，並依標示加入10μl之對應液體
- 放入恆溫培養箱隔夜培養，隔日觀察並測量抑菌圈大小以推測各物質對於細菌生長之影響
紫外光照5分鐘 紫外光照20分鐘 抑菌圈
三.微生物的染色方法
- 熱固定法
- 於乾淨之載玻片中央，置5μL 無菌水，再以tip輕沾培養基上之少許E. coli菌落，並與無菌水均勻混合
- 將載玻片置於酒精燈上，快速來回移動以將水分蒸發、便能使菌體固定於玻片上
熱固定法
- 簡單染色(Simple staining)
- 使用熱固定法固定E. coli於玻片上
- 使用結晶紫染劑滴２－３滴於玻片上，靜置１分鐘，待其固色
- 於染槽上以蒸餾水洗滌瓶將多餘的染劑沖掉
- 覆上蓋玻片，並使用顯微鏡觀察菌體的型態與顏色並拍攝之(見圖)
E.coli
- 負染色(Negative staining)
- 取一滴Nigrosin染劑於玻片邊緣
- 使用tip勾一點Escherichia coli菌落於染劑中均勻混合
- 使用另一片乾淨玻片將染劑和菌體鋪平，並蓋上蓋玻片以顯微鏡觀察並拍攝之
負染色法 E.coli
- 革蘭氏染色(Gram's staining)
- 將E. coli及金黃色葡萄球菌熱固定於不同載玻片之上，平放於架子上，先以2%結晶紫染劑滴於載玻片上菌體，作用１分鐘，再以蒸餾水將剩餘染料沖洗去除
- 加入碘液，作用１分鐘，用蒸餾水洗瓶沖洗
- 再以95%酒精進行脫色作用。用手斜拿玻片，由上往下滴入95%酒精溶液（約３０秒），直到流出的酒精變為無色
- 加入第二種染液Safranin(Counterstain)，繼續作用三分鐘後，用水沖掉多餘之染料，吸去玻片上之水分，於顯微鏡下仔細觀察
- 先以低倍鏡找出含有菌體的位置，逐次增加倍數，最後加入一滴油鏡油，以１００倍油鏡觀察細胞外之外型與顏色，並拍攝之
革蘭氏染色法
金黃色葡萄球菌 E. coli
課程心得
下午由藍忠昱教授指導我們更多有關微生物這門學問的更多知識。教授是一位十分有趣的人，他會在課堂中用一些巧妙的比喻和隨機問答的方式使我們在上課時能更好的吸收內容。我們知道了許多微生物的種類，而科學家至今發現的微生物種類甚至不到地球上的1/10。還有好菌對身體的好處，希望未來可以盡量不使用抗生素殺細菌，而是增加體內的好菌含量進而促進身體的抵抗能力。
實驗的部分，由於這是我第一次使用loop這種實驗器材，在操作上較不熟悉。而下午的染色部分則因為SA脫色過度而呈現紅色並非理論上的藍黑色。其他組染色則皆有觀察出結果。