Day4+5微生物專題

感謝 藍忠昱教授、兩位超carry的助教、飽受摧殘的培養基、被我們殺死的E.coli

材料與設備

菌種：大腸桿菌(E.coli)

器材：接種環、酒精燈、70%酒精、三角玻棒、燒杯

試劑與培養基：95%酒精、37℃培養箱、LB固體培養基(Luria-Bertani agar)、LB培養液(Luria-Bertani broth)

塗抹法(Spreading Method)

1.以微量吸管吸取0.1mL之大腸桿菌菌液，滴於LB Plate上。

2.取一三角形之玻棒，先置於95%酒精燒杯中，取出過火使酒精燃盡。稍待片刻帶玻棒冷卻後，右手持玻棒混勻菌液，左手則旋轉LB Plate，務必要將0.1mL之菌液均勻分布於LB Plate上。

3.於37℃培養箱內培養，隔天觀察細菌菌落之形成。

細菌之分離與純培養分區劃線法(Streaking Method)

1.以滅菌接種環挑取大腸桿菌單一菌落，於LB plate上沿平行線將菌落劃開，此為第一區。

2.將接種環以酒精燒紅，殺死上面沾有之細菌，冷卻後再由劃過之第一區內，沾取少部分之菌落，將plate輕轉90度，亦以平行線劃開，此為第二區。

3.依同法再由第二區劃出第三區。

4.最後一區劃線時，線條盡量拉開，不可太過密集，如此隔夜培養後，可得到分散之單一菌落(single colony)。

材料與設備

菌種：大腸桿菌(E.coli)

設備：酒精燈、三角玻棒、37℃培養箱、鑷子、圓形紙錠

化學物質：Ampicillin(10mg/mL)、蒜頭萃取液、70%酒精、10%漂白水、無菌水)

試劑與培養基：LB Plate*3盤

紫外光照射實驗

1.準備大腸桿菌的稀釋菌液、取兩個LB Plate。

2.取出菌液0.1mL，均勻分散於LB Plate上(塗抹法)。

3.將塗好菌之LB Plate，置於太陽光或無菌操作台之紫外光下，並將蓋子打開。

4.以太陽光/紫外光照射，分別作用5分鐘或20分鐘，對照組0秒則不照射紫外光。

5.將各培養皿置於37℃培養，隔天觀察並計算菌落數，而知紫外光對細菌生長的影響。

化學物質感受性實驗(Chemicals Susceptibility Test)

1.準備大腸桿菌之隔夜培養液一管。

2.將一個LB Plate以簽字筆分別標不同化學藥劑代表字母。

3.自培養液中吸取0.1mL菌液，以三角玻棒均勻密塗(塗抹法)於LB Plate。

4.將鑷子過火，夾取Ampicillin圓形濾紙直接貼上LB Plate。

5.鑷子過火完，再夾取四片無菌圓形濾紙，貼至塗好菌的LB Plate上，再分別加入10µL待測物及無菌水(對照組)。

6.注意每使用一次鑷子記得過火(95%酒精)，各紙錠保持一定距離。

7.於37℃隔夜培養後，觀察抗生素抑制細菌生長之情形，測量抑菌圈(Zone of Inhibition)之直徑大小並記錄。

熱固定法

1.先在乾淨之玻片中央，置入5µL無菌水，再以tip清沾培養基上之E.coli菌落(不要取太多菌)，與無菌水均勻混合後，以簽字筆註明菌名。

2.塗抹之玻片為半透明、白色的一層膜狀物，快速在酒精燈上加熱2-3次，以便將菌體固定於玻片上。

革蘭氏染色(Gram's staining)

1.將熱固定過之玻片E.coli及S.A，先以2%結晶紫染劑滴於載玻片上之菌體，作用1分鐘，再以蒸餾水將剩餘染料沖洗去除。

2.加入碘液媒染液(加深結晶紫的顏色)，作用1分鐘，用蒸餾水洗瓶沖洗。

3.再以95%酒精進行脫色作用。用手斜拿玻片，由上往下滴入95%酒精溶液(約30秒)，直到流出的酒精變成無色。

4.加入第二種染液(番紅)，作用3分鐘後，用水沖掉多餘染料，以拭鏡紙吸去多餘水分，蓋上蓋玻片，於顯微鏡底下觀察。

5.使用100X油鏡觀察。

E.coli(大腸桿菌) 全名 Escherichia coli

大腸桿菌是人類和其他溫血動物腸道中的正常菌種，所以食品一 旦出現大腸桿菌，即意味著食品直接或間接的被污染，故在衛生學上，常被用做飲水、食品的衛生檢定指標。

巴斯德滅菌法(低溫殺菌法) Pasteurization

通常係將液體或其他物質加熱至足以使致病性細菌死亡之溫度，且於此溫度下維持充分之時間，作為一種特殊性應用。一般常用於牛奶之消毒，例如將牛奶之溫度提高至71℃，15秒或61.6℃維持30分鐘，然後急速冷卻至10℃或更低之溫度，而完成消毒。

要使用何種方法在實驗室培養生活在極高溫環境下的微生物