老師介紹-林立元
學歷
美國康乃爾大學畜牧學系博士
研究
分子生物學(Molecular Biology)
分子毒理學(Molecular Toxicology)
生物化學(Biochemistry)
研究主題:細胞訊息傳遞、p53 調控、自噬作用(autophagy)及癌症相關分子機制
目前職位
國立清華大學生命科學系及分子與細胞生物研究所榮譽退休教授
課程簡介
這堂課主要聚焦於實驗,上課內容僅簡單帶過
壹、上課內容
1.使用手電筒照射光碟片,可看見天花板上出現類似彩虹的光影;若在手電筒前加裝不同顏色的壓克力片,以黃色壓克力片為例,可見天花板上出現黃光、橙光、紅光,顯現偏暖色系的繞射圖樣。CD之所以能分光,是因為其表面佈滿密集的凹槽,整齊排列形成反射式光柵,可以將不同波長的光反射並進行干涉,從而分解成彩色光譜。
左圖為直接使用手電筒照射光碟所拍攝之照片
右圖為手電筒隔著壓克力片照射光碟所拍攝之照片
2.光反應:植物光合作用發生於葉肉組織細胞內的葉綠體,光反應在葉綠體中的囊狀堆疊構造->類囊體進行
3.綠色螢光蛋白(Green Fluorescent Protein, GFP)是一種最早從水母中發現的螢光蛋白,受到藍光或紫外光照射時會發出綠色螢光。由於 GFP 不需額外添加試劑即可發光,因此常作為生物學研究中的報導基因(reporter gene),用來觀察蛋白質的位置、基因表現及細胞活動。 錢永健(Roger Y. Tsien)於 2008 年獲得諾貝爾化學獎,主要貢獻是發展並改良綠色螢光蛋白(GFP)的應用。
4.生物冷光反應(Bioluminescence)是生物利用化學反應產生光的現象,常見於螢火蟲、發光細菌和部分海洋生物。此反應通常由螢光素(luciferin)在螢光素酶(luciferase)催化下,與氧氣反應產生光,由於幾乎不產生熱,因此稱為「冷光」。生物冷光常被應用於生物醫學研究、基因表現分析及疾病檢測。
5.此圖說明植物光合作用的光反應,發生在葉綠體的類囊體膜上。光能先激發光系統 II(PSII),使水分解產生氧氣、電子和 H⁺;電子沿著電子傳遞鏈移動,並促使 H⁺ 累積在類囊體內腔,形成濃度梯度。接著電子到達光系統 I(PSI),再次吸收光能後將 NADP⁺ 還原成 NADPH;同時 H⁺ 經由 ATP 合成酶流回基質,驅動 ATP 的生成。最後,光反應產生的 ATP 和 NADPH 會提供給後續的卡爾文循環,用來固定二氧化碳並合成葡萄糖。
6.此圖說明葉綠素吸收光能後電子的能量變化。當葉綠素吸收藍光或紅光時,電子會由基態(ground state)躍遷到激發態(excited state),之後電子會先釋放部分能量形成熱,再回到較低激發態,最後回到基態時以螢光(fluorescence)或將能量傳遞給光合作用反應中心的方式釋放能量。因此,光能的吸收會使電子激發,並將光能轉換成可供光合作用利用的化學能。
貳、實驗內容
1.上午
(一)將各種顏色燈卡插入光譜儀,觀察顏色
(二)使用光譜儀,插入燈卡用水校正,再切換成紅墨水量其吸光值,分6次紀錄
(三)選用波長515nm之燈卡(吸光值最大者),將紅墨水逐一稀釋,繪製圖表、計算相關係數、斜率
我們這組的數據:相關係數r=0.9833,m=1.6936
(四)選用波長590nm之橙卡,將紅墨水逐一稀釋,繪製圖表、計算相關係數、斜率
我們這組的數據:相關係數r=0.9904,m=0.1638
(五)將紅墨水放入專業儀器,拍出各種波長下的吸光值
2.下午
(一)將葉子、萃取葉綠素、500元、1000元的樣品放入藍光照光箱,觀察樣品
發現:葉子紅色部分特別明顯,萃取葉綠素發出紅光,500元及1000元上的螢光防偽標示發亮
葉子與葉綠素發出紅光原因:葉片中的葉綠素吸收了高能量的光線後,光反應系統的電子被激發卻無法進行光合作用,從而導致墊子調回原本的能接並散發特定波長的能量,平時這道紅光會被強烈的太陽光遮蓋,但只要在暗室中以藍光激發,並搭配濾光片阻擋藍光干擾,就能清楚看見紅光。
(二)葉綠體光反應實驗
(1)全黑:將cuvette留在光譜儀中,每30秒記錄一次
1.分離葉綠體:將2公克洗乾淨的葉子放入研缽中,放在冰上搗碎,再將裏面殘渣濾掉,留下內含葉綠體的濾液
2.稀釋葉綠體至吸光值0.4~0.6:將濾液取400μmL,和大約1.7mL的ddH2O混和
3.加入100μL DCIP混和均勻,測量於590nm的吸光值
本組在無光照環境下,無法啟動光反應,DCIP 無法獲得電子而保持氧化態,A590吸光值非常接近。
2)照光:和全黑實驗的步驟一樣,但是測量過程要照光,其餘時間保持黑暗
本組在光照下進行光反應,水光解產生的電子經傳遞鏈傳向 DCIP 使其還原褪色(氧化狀態呈藍色,還原為透明),因此 A590吸光值隨時間呈下降趨勢。
3)加DCMU: 和前面一樣,但加入DCIP前,先加100μL DCMU反應2分鐘
此組加入的電子傳遞抑制劑 DCMU 阻斷了電子從 PSII 流向質體醌PQ,中斷電子傳遞鏈,導致 DCIP 無法獲得電子,吸光值因而維持恆定。
參考資料
老師簡報