プロトコール
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HaCaT細胞もしくは，HEK293F細胞を利用した場合のプロトコールを示す．
準備するもの
・ターゲットゲノム切断ベクター（pX330を利用 https://www.addgene.org/42230/ ）
・ドナーベクター※（pVKG1_PURO，Puromycin耐性，Addgeneより配布予定）
・ドナー切断ベクター※（pX330_VKG1，Addgeneより配布予定）
※ドナー切断ベクターとドナーベクターとを合わせて「VIKINGモジュール」を呼びます．ターゲットゲノムの配列にかかわらず利用可能です．
Addgene経由で配布しています（https://www.addgene.org/browse/article/28193003/）．
日本国内からのリクエストにはこちら、もしくは、shun-sawa2@tokushima-u.ac.jpもしくは，shigeo.sugano@aist.go.jpでも対応しております．
手順
Step１：細胞培養
HaCaT細胞またはヒト胎児腎細胞293F（HEK293F）細胞を，ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）（043-30085; Wako，Osaka，Japan）に10％ウシ胎仔血清（S1780-500; Biowest，Nuaille，France）および1Uペニシリン・ストレプトマイシン（161-23181; Wako）を加えた培地(D10培地)で培養を行う．
Step２：遺伝子導入
◆エレクトロポレーション法
HaCaT細胞をOpti-MEM（11058-021; Life Technologies）に懸濁し，VIKINGモジュールおよびpX330プラスミドを合計15 μgのDNA（モル比，ドナー切断用プラスミド（pX330_VKG1）：ドナープラスミド：ターゲット切断プラスミド＝１：１：１７）をエレクトロポレーター（CUY21EDITII; Bex，Tokyo，Japan）を用いて，エレクトロポレーションにより導入する．エレクトロポレーションした細胞を，100 mmディッシュにうつし，抗生物質を含まないD10培地中で24時間前培養する．
◆リポフェクション法
HEK293F細胞に，VIKINGモジュールおよびpX330プラスミドを合計15μg（モル比，pX330_VKG1：ドナープラスミド：ターゲット切断プラスミド＝１：１：１７）のDNAをTurboFectトランスフェクション試薬（R0531; Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA）を用いて導入する．細胞は100 mmディッシュにうつし，抗生物質を含まないD10培地中で24時間前培養する．
Step３：選抜
形質転換された細胞を培地に展開する．D10培地にはピューロマイシン（0.3 μg/ mL）を加えて14日間細胞を培養する．
ピューロマイシンに耐性を示すシングルコロニーを単離し，24 well プレートにうつす．
24 wellプレートで数日間培養後，100 mm ディッシュにうつして培養する．一部はジェノタイピングのためにDNA抽出を行う．
Step４：DNA抽出
細胞の一部からDNA抽出を行う．DNA抽出は通常のプロトコールにしたがう．
例えば，OpenWetwareを参照．
https://openwetware.org/wiki/DNA_extraction_from_tissue
Step５：ジェノタイピング（PCRによるノックインの確認）
抽出したDNAをテンプレートとして，PCRを利用してノックイン挿入とランダム挿入の確認を行う．
PCRに利用する酵素には，特別なものを利用する必要はない．
本プロトコールではGoTaq Polymerase (Promega, M3001)を利用する．
◆必要なプライマーの設計
図：ジェノタイピングの概念図
VKG1配列を挟むようにプライマーを設計する．
例：
Primer1 (VKG1_4561F), 5'-GCCTATGGAAAAACGCCAGC-3'
Primer2 (VKG1_250R), 5'-TTCCTGTCTAGCGGTACGCG-3'
ターゲットゲノム配列特異的に結合するプライマーを設計する．
例：
Primer3 (VDRgenome_del3F),5'-GGTGGGCCTCATGTCTTCTG-3'
Primer4 (VDRgenome_del1R),5'-CCTTCATCATGCCGATGTCC-3'
◆PCRによるジェノタイピング
PCR反応
2ｘ GoTaq® GreenMaster Mix 12.5 uL
10 uM Primer A 2.5 uL
10 uM Primer B 2.5 uL
Nuclease-Free water 6.5 uL
genome DNA 1 uL
Total 25 uL
thermocycler cycle
95℃ 2 min
[95℃ 30 sec、55℃ 1 min 、72℃ 2 min] x 30 cycles
72℃ 4min
12℃ hold
Step1. ランダム挿入の確認
Primer1, Primer2 を用いてPCRを行う．
DNA断片が増幅すれば，ランダム挿入が見られると判断する．
Step2. ターゲットゲノムへのノックインの確認
-順方向
Primer1とPrimer3, Primer2とPrimer4を用いてPCRを行う．
DNA断片が増幅すれば，順方向のノックインがされたと判断する．
-逆方向
Primer2とPrimer3, Primer1とPrimer4を用いてPCRを行う．
DNA断片が増幅すれば，逆方向のノックインがされたと判断する．