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Welcome to the VIKING method
Easy and fast knock-in for any cell line!
・English page is here
VIKING(Versatile non-homologous end joining-based knock-in module for genome editing)法は，
遺伝子導入可能な細胞において，簡便に高効率なノックインを実現する技術です．
VIKING法は，NHEJ修復を利用したノックイン技術を下記の２点で改良したものです．
１．ドナーベクター，ゲノム編集ベクターの導入する比率を最適化（75%の細胞でランダムな挿入なしのノックイン）
２．VKG1配列を用いるので，既存ベクター※を全く改変せずにドナーベクターとして利用可能
※ pUC, pBluescript II (+), pcDNA3, pENTR ... などの標準ベクターはVKG1配列を含んでいるため，ノックインに利用できます．
・論文
"Development of versatile non-homologous end joining-based knock-in module for genome editing"
Shun Sawatsubashi, Yudai Joko, Seiji Fukumoto, Toshio Matsumoto, Shigeo S. Sugano
Scientific Reports, 2018
"Protocol for CRISPR/Cas9-based knock-in using the VIKING method"
Yudai Joko, Shigeo S. Sugano, Seiji Fukumoto, Toshio Matsumoto, Shun Sawatsubashi
Protocol Exchange, 2019
・ 培養細胞における簡便なノックインを可能とするゲノム編集法：VIKING法 2019年７月号（Vol.37 No.11）「実験医学」
図：VIKING法の概要
動作原理①：NHEJ修復を利用したノックイン
VIKING法は，非相同末端結合(non homologous end joining, NHEJ)修復を利用したノックイン技術(ObLiGaReなど1-2)を利用しています．一般的に，細胞の中でゲノムDNAに切断が生じた場合，NHEJ修復または相同組換え（homologous recombination, HR) 修復が起こりますが，NHEJ修復はHR修復に比べて高頻度でおこるDNA修復経路です3．今まで，ノックイン技術にはHR修復が利用されてきました．HR修復が低頻度でしか起こらないために，今までの手段でノックインが成立した細胞を取得するには，多数の細胞へドナーベクターを導入し，わずかに存在するノックイン細胞を選抜する必要がありました．NHEJ修復を利用した場合，HR修復よりはるかに高頻度でおこるため，ノックインの成立も高頻度で起こると考えられています1-2．そのため，VIKING法では，三つのベクター（ドナーベクター(A)，ドナー切断用ベクター(B)，ターゲット切断ベクター(C)）を同時に細胞に導入します．三つのベクターを導入すると，まず，ドナー切断用ベクターから生じる人工DNA切断酵素が，細胞内でドナーベクターを切断します（図：緑色のハサミ）．さらに，ターゲット切断ベクターがゲノムの狙った位置を切断します（図：青色のハサミ）．切断されたドナーベクターの末端と，ゲノムの断片の末端が，NHEJ修復により結合して，ノックインが起こります．ノックインが起こらなかった染色体では，一定確率でフレームシフトの誘導によるノックアウトが起こります（図：indelによるノックアウト）．これらの技術は，Maresca博士ら（TALENの利用）あるいはCristea博士ら（ZFNの利用）により，2012年に提案されており1-2，活用も進んできています．私たちは，彼らの技術に大きな敬意と感謝をもっています．
動作原理②：VIKING法の強み
VIKING法では，ドナーの切断のために「VKG1配列」という配列の利用を提案しています（図：緑「×」部）．VKG1配列はさまざまなベクターに存在しているので，VKG1配列を持つベクターをドナーとして利用する限り，ドナーベクターとドナー切断用ベクターのいずれも改変する必要がありません（図：VIKING汎用モジュール）．VIKING法では，さらに，NHEJ修復依存的ノックインのためのベクター導入条件を最適化しました．論文では，ランダムな挿入ができるだけ少なく，ノックイン効率が高い条件を示しています．NHEJ修復依存的ノックインは既に多くの報告がなされており，最適化も進んでいます4-10．改良版であるVIKING法も，幅広い細胞種，生物種にも適用可能であると考えています．
動作確認済みの細胞（2018年１月現在）
HaCaT (human, aneuploid keratinocyte cell line)
HEK293F (human, embryonic kidney cells)
C4-2 (human, prostate cancer cell line)
UMR-106 (rat, osteogenic cell line)
特許情報
VIKING法に関する特許を徳島大学から出願済みです．
産業利用にご興味ある場合は，shun-sawa2 at tokushima-u.ac.jp（at を@としてください）までご連絡ください．
アカデミアで実施される研究へのご利用には，制限はありません．
研究体制
沢津橋俊（徳島大学）shun-sawa2 at tokushima-u.ac.jp
菅野茂夫（産業技術総合研究所）shigeo.sugano at aist.go.jp
atを@としてください．
Related studies:
1. Maresca et al. Obligate ligation-gated recombination (ObLiGaRe): custom-designed nuclease-mediated targeted integration through nonhomologous end joining. Genome Res 23, 539-546 (2013).
2. Cristea et al. In vivo cleavage of transgene donors promotes nuclease-mediated targeted integration. Biotechnol Bioeng 110, 871-880 (2013).
3. Haber "Genome stability" 2013. Garland Science
4. Auer et al. Highly efficient CRISPR/Cas9-mediated knock-in in zebrafish by homology-independent DNA repair. Genome Res 24, 142-153 (2014).
5. Lackner et al. A generic strategy for CRISPR-Cas9-mediated gene tagging. Nat Commun 6, 10237 (2015).
6. Kimura et al. Efficient generation of knock-in transgenic zebrafish carrying reporter/driver genes by CRISPR/Cas9-mediated genome engineering. Sci Rep 4, 6545 (2014).
7. Schmid-Burgk et al. CRISPaint allows modular base-specific gene tagging using a ligase-4-dependent mechanism. Nat Commun 7, 12338 (2016).
8. Li et al. Gene replacements and insertions in rice by intron targeting using CRISPR-Cas9. Nat Plants 2, 16139 (2016).
9. Katoh et al. Practical method for targeted disruption of cilia-related genes by using CRISPR/Cas9-mediated, homology-independent knock-in system. Mol Biol Cell 28, 538 898–906 (2017).
10. Tálas et al. A convenient method to pre-screen candidate guide RNAs for CRISPR/Cas9 gene editing by NHEJ-mediated integration of a 'self-cleaving' GFP-expression plasmid. DNA Res 24, 609–621 (2017).
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