Aula 2

 DIAGNOSE DE ENFERMIDADES VEGETAIS

1. INTRODUÇÃO

2. SINTOMATOLOGIA

2.1. CONCEITO

2.2. CLASSIFICAÇÃO DE SINTOMAS

2.2.1. CRITÉRIOS UTILIZADOS PARA A CLASSIFICAÇÃO

2.2.2. CLASSIFICAÇÃO MORFOLÓGICA

3. TESTES UTILIZADOS NA DETECÇÃO E DIAGNOSE DE FITOPATÓGENOS

3.1. BIOLÓGICOS

3.2. FÍSICO – QUÍMICOS

3.3. SOROLÓGICOS

3.4. MOLECULARES

4. REGRAS DE PATOGENICIDADE (POSTULADOS DE KOCH)

• ATENÇÃO: Os textos abaixo estão relacionados ao teor resumido das aulas devendo, portanto, serem complementados com a Bibliografia recomendada (http://sites.google.com/site/paulobrioso/bibliografia)

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1.    Introdução:

Em Fitopatologia são conhecidos 5 (cinco) períodos:

-          Período Místico, da Predisposição, Etiológico, Ecológico e Atual.

Os três últimos períodos foram os quais os testes diagnósticos mais evoluíram.

Existem 2 (dois) tipos de Diagnose:

Indireta - Baseada exclusivamente nos Sintomas 

Direta - Baseada nos Sintomas e Sinais

         A coleta, acondicionamento e remessa das amostras para a análise são atividades de fundamental importância e variam com o tipo de fitopatógeno a ser pesquisado e com o sintoma apresentado pela planta.

2.    Sintomatologia:

2.1. Conceito:

         É a ciência que estuda os sintomas decorrentes das enfermidades dos vegetais.

2.2. Classificação de Sintomas:

2.2.1. Critérios utilizados para a Classificação:

         Na classificação dos sintomas podem ser utilizados os seguintes critérios:

I – Localização dos Sintomas em relação ao agente etiológico

·         Sintoma Primário

·         Sintoma Secundário

II – Alteração a nível celular (Sintomas Histológicos)

·         Granulose

·         Plasmólise

·         Vacuolose

III – Alteração a nível da fisiologia da célula (Sintomas Fisiológicos)

·         Respiração

·         Transpiração

·         Síntese de Carbohidratos

·         Síntese de Enzimas

·         Síntese de Proteínas

IV – Alteração a nível de anatomia ou forma do Orgão (Sintomas Morfológicos)

2.2.2. Classificação Morfológica (Link):

Observação: Veja o Glossário para definição dos Termos abaixo.

- Sintomas Necróticos:

         São os sintomas que antecedem a morte ou a morte propriamente dita dos tecidos.

·Plesionecrótico - Amarelecimento, Anasarca ou Encharcamento, Murcha.

Holonecrótico - Cancro, Canelura ou "Stem Pitting", Crestamento ou Requeima, “Damping Off” ou Tombamento, Escaldadura, Estria ou Listra, Fendilhamento ou Rachadura, Gomose, Mancha, Mumificação, Necrose Vascular, Perfuração, Podridão, Pústula, Resinose, Seca, Seca dos Ponteiros ou “Die Back”

- Sintomas Plásticos:

         Envolve um subdesenvolvimento ou super desenvolvimento dos tecidos ou de função dos mesmos.

Hipoplástico - Albinismo, Afilamento foliar, Clareamento de Nervura, Clorose, Enfezamento ou Nanismo, Mosaico, Mosqueado, Roseta.

Hiperplástico – Bronzeamento, Calo Cicatricial, Enação, Encarquilhamento ou Encrespamento, Epinastia, Espessamento de Nervura, Fasciação, Galha, Superbrotamento, Verrugose.

2.2.3. Sintoma X Sinal:

Infecção Latente – Infecção sem apresentar sintoma visível

Estímulo a Exteriorização do Sinal (Câmara Úmida associada a temperatura ótima)

3. Testes utilizados na Diagnose de Fitopatógenos:

3.1. Testes Biológicos (Exemplos):

-          Iscas Biológicas (por exemplo: Batatinha, Folha de Mamona, Maçã, Pimentão, Tomateiro, etc) (principalmente, para Bactéria, Fungo, Nematóide, Straminipila) exemplificado através da Instrução Normativa número 28 (MAPA).

-          Enxertia (principalmente, para patógenos sistêmicos ou de não transmissão mecânica)

-          Plantas Indicadoras (principalmente, para Vírus e Viróide)

-          Plantas Diferenciadoras (principalmente, para Fungos, Vírus e Nematóides)

-          Transmissão por Cuscuta sp. (principalmente, para Vírus e Fitoplasma)

-          Vetor (Ácaro, Chytrídeo, Inseto, Nematóide, Plasmodiophorideo)

3.2. Testes Físico - Químicos (Exemplos):

I - Microscopia Ótica

-     Lâmina e Lamínula - Montado em Água (Alga, Bactéria, Chytrídeo, Espiroplasma, Fungo, Nematóide, Plasmodiophorideo, Protozoário, Straminipila) ou Corante (Fungo).

-    Secções Histológicas associadas a Corantes Específicos – Alga, Bactéria, Chytrídeo, Espiroplasma, Fitoplasma, Fungo, Nematóide, Plantas Infestantes e Parasitas, Plasmodiophorideo, Protozoário, Straminipila, Vírus (agregados protéicos).

II - Microscopia Eletrônica

- Secções Histológicas associadas a Corantes Específicos – Alga, Bactéria, Chytrídeo, Espiroplasma, Fitoplasma, Fungo, Nematóide, Plantas Infestantes e Parasitas, Plasmodiophorideo, Protozoário, Straminipila, Vírus.

III - Eletroforese

- Proteína - Bactéria, Chytrídeo, Espiroplasma, Fitoplasma, Fungo, Nematóide, Protozoário, Straminipila, Vírus

- DNA – Alga, Bactéria, Chytrídeo, Espiroplasma, Fitoplasma, Fungo, Nematóide, Plantas Infestantes e Parasitas, Plasmodiophorideo, Protozoário, Straminipila, Vírus

- RNA – Viróide, Vírus

3.3. Testes Sorológicos (Exemplos):

Os testes abaixo usam Anticorpos contra Proteína (s) específicas relacionadas a fitoparasitas (Bactéria, Chytrídeo, Espiroplasma, Fitoplasma, Protozoário, Vírus). Sendo, atualmente, mais utilizado em Vírus e para alguns gêneros de Bactéria (por exemplo, Ralstonia solanacearum).

-    Difusão Dupla em Gel de Agar

-    ELISA (“Enzyme Linked Immunosorbent Assay”) e suas modalidades

-    Imunocromatográfico

-    “Western Blot”

Anticorpos específicos contra Proteína (s) - Bactéria, Chytrídeo, Espiroplasma, Fitoplasma, Protozoário, Vírus. Sendo, atualmente, mais utilizado em Vírus e para alguns gêneros de Bactéria (por exemplo, Ralstonia solanacearum).

3.4. Testes Moleculares (Exemplos):

“Northern Blot” (usado para RNA)

“Southern Blot” (usado para DNA)

“PCR” (“Polymerase Chain Reaction”) e suas modalidades (usado para DNA)

“RT – PCR” (“Reverse Transcriptase - Polymerase Chain Reaction”) (usado para RNA)

“Dot Blot”

“RFLP” (“Restriction Fragment Length Polymorphism”)

Sequenciamento de Nucleotídeos

    Para a diagnose de Alga, Bactéria, Chytrideo, Espiroplasma, Fitoplasma, Fungo, Nematóide, Plantas Infestantes e Parasitas, Plasmodiophorideo, Protozoário, Straminipila, Viróide, Vírus.

    Na Tabela 1 são listados os principais testes adotados na detecção e diagnose dos fitopatógenos e parasitas

Tabela 1. Principais testes utilizados na detecção e diagnose dos fitopatógenos

Alga

Isolamento em Meio de Cultura (parasita facultativo); Microscopia Ótica, Microscopia Eletrônica de Transmissão, Microscopia Eletrônica de Varredura; Dot Blot, Southern Blot, PCR com primers específicos ou degenerados, multiplex PCR, PCR-RFLP, Sequenciamento de nucleotídeos

Bactéria

Exsudação bacteriana, Teste de Enxertia, Teste de Hipersensibilidade em Fumo ou em Tomate, Teste de Isolamento com Plantas Iscas, Transmissão por inseto-vetor (cigarrinha - específico para Xylella sp.); Isolamento em Meio de Cultura, Teste de Crescimento em Meios Específicos, Teste de Gram, Microscopia Ótica, Microscopia Eletrônica de Transmissão; ELISA e suas modalidades, Imunocromatográfico; Dot Blot, Southern Blot, PCR com primers específicos, Bio PCR, multiplex PCR, nested PCR, Real Time PCR, PCR-RFLP, Sequenciamento de nucleotídeos

Chytrideo

Teste de Isolamento com Plantas Iscas; Microscopia Ótica, Microscopia Eletrônica de Transmissão, Microscopia Eletrônica de Varredura; Dot Blot, Southern Blot, PCR com primers específicos, PCR-RFLP, Sequenciamento de nucleotídeos

Espiroplasma

Isolamento em Meio de Cultura, Transmissão por inseto-vetor (cigarrinha); Teste de Gram, Microscopia Ótica, Microscopia Eletrônica de Transmissão; ELISA e suas modalidades, Imunocromatográfico; Dot Blot, Southern Blot, PCR com primers específicos, multiplex PCR, nested PCR, Bio-PCR, Real Time PCR, PCR-RFLP, Sequenciamento de nucleotídeos

Fitoplasma

Teste de Enxertia, Transmissão por Cuscuta sp., Transmissão por inseto-vetor (cigarrinha ou psilídeo); Microscopia Ótica com corantes específicos, Microscopia Eletrônica de Transmissão; ELISA e suas modalidades; nested PCR, PCR-RFLP, Sequenciamento de nucleotídeos

Fungo

Isolamento em Meio de Cultura (parasita facultativo), Teste de Inoculação em Plantas Indicadoras ou de Isolamento com Plantas Iscas, Teste de Enxertia; Microscopia Ótica, Microscopia Eletrônica de Transmissão, Microscopia Eletrônica de Varredura; Dot Blot, Southern Blot, PCR com primers específicos ou degenerados, multiplex PCR, PCR-RFLP, Sequenciamento de nucleotídeos

Nematóide

Testes de Inoculação com Plantas Iscas ou Diferenciadoras; Teste de Trituração, Fragmentação, Peneiramento e Sedimentação de Material Vegetal, Microscopia Ótica, Microscopia Eletrônica de Transmissão, Microscopia Eletrônica de Varredura; Eletroforese de Isoenzima; Dot Blot, Southern Blot, PCR com primers específicos ou degenerados, multiplex PCR, PCR-RFLP, Sequenciamento de nucleotídeos

Plantas Infestantes e Parasitas

Microscopia Ótica, Microscopia Eletrônica de Transmissão; Dot Blot, Southern Blot, PCR com primers específicos ou degenerados, PCR-RFLP, Sequenciamento de nucleotídeos

Plasmodiophorídeo

Testes de Inoculação com Plantas Iscas; Microscopia Ótica, Microscopia Eletrônica de Transmissão; Dot Blot, Southern Blot, PCR com primers específicos ou degenerados, PCR-RFLP, Sequenciamento de nucleotídeos

Protozoário

Teste de Enxertia, Transmissão por Inseto-Vetor (percevejo); Microscopia Ótica, Microscopia Eletrônica de Transmissão, Microscopia Eletrônica de Varredura;; ELISA e suas modalidades, ISEM, Western Blot; Dot Blot, Southern Blot, PCR com primers específicos ou degenerados, PCR-RFLP, Sequenciamento de nucleotídeos

Straminipila

Isolamento em Meio de Cultura (parasita facultativo), Teste de Inoculação em Plantas Indicadoras ou de Isolamento com Plantas Iscas; Microscopia Ótica, Microscopia Eletrônica de Transmissão, Microscopia Eletrônica de Varredura; Dot Blot, Southern Blot, PCR com primers específicos ou degenerados, PCR-RFLP, Sequenciamento de nucleotídeos

Viróide

Testes de Transmissão Mecânica (em Plantas Indicadoras ou Diferenciadoras), Teste de Enxertia; Eletroforese em Gel de Poliacrilamida (Bidirecional); Dot Blot, Northern Blot, RT-PCR com primers específicos, multiplex PCR, Real Time PCR, Sequenciamento de nucleotídeos

Vírus

Testes de Transmissão Mecânica (em Plantas Indicadoras ou Diferenciadoras), Teste de Enxertia, Transmissão por Cuscuta sp.; Transmissão por Vetores (ácaro, chytrídeo, inseto, nematoide, protozoário); Microscopia Eletrônica de Transmissão; ELISA e suas modalidades, ISEM, Teste Imunocromatográfico, Western Blot; Dot Blot, Northern Blot, Southern Blot, PCR ou RT-PCR com primers específicos ou degenerados, Lamp PCR, multiplex PCR, Real Time PCR, RCA, RCA-RFLP, Sequenciamento de nucleotídeos

4. Regras de Patogenicidade (Postulados de Koch):

    Conjunto de regras a se utilizar para estabelecer cientificamente que um fitoparasita é um patógeno.

I - Associação constante sintoma e sinal

II - Isolamento, do organismo observado, em cultura pura

III - Inoculação, de cultura pura do organismo observado, em indivíduo suscetível e sadio

IV - Re-isolamento, do organismo inoculado, em cultura pura

Observação: No caso de parasitas obrigatórios, só se utiliza o item I e III para cumprir os Postulados de Koch

Parasita Facultativo – Alga, Bactéria, Espiroplasma, Fungo, Protozoário, Straminipila.

Parasita Obrigatório - Chytrídeo, Fitoplasma, Fungo, Nematóide, Plantas Infestantes e Parasitas, Plasmodiophorideo, Viróide, Vírus (Não se realizam os Postulados: Isolamento do organismo observado em cultura pura; Re-isolamento do organismo inoculado em cultura pura).

DOENÇAS CORRELACIONADAS - Link

BIBLIOGRAFIA RECOMENDADA

         A lista bibliográfica para estudo dos tópicos acima listados pode ser acessada no endereço eletrônico http://www.fito2009.com/fitop/fitoppat.htm ou http://sites.google.com/site/paulobrioso