微生物學專題(三)

微生物的染色方法

實驗目的

微生物因為體積微小呈半透明狀，懸浮於水上時幾乎無色，非常不容易觀察其形體形狀。通常菌體多為無色，因此以水懸浮液鏡檢時，不易與水區別出來；當染色後，較易與周圍環境分別而利於檢視。某些染色法可用來鑑別細胞內部構造；另外，使用油鏡可提高放大倍率亦有助於檢視。

實驗材料與設備

(1)菌種：E. coli 、S.A.

(2)設備：載玻片、光學顯微鏡、接種環、酒精燈、鑷子

(3)試劑和培養基：無菌蒸餾水、95 percent酒精、鏡油、2 percent Grams crystal violet 、Grams Iodine 、 0.5 percent Safranin

簡單染色 Simple staining

利用熱固定法固定E. coli於玻片，滴2-3滴crystal violet並靜置一分鐘

負染色 Negative staining

取一滴Nigrosin於玻片邊緣，使用tip勾一點E. coli和染劑混合。使用另一乾淨玻片將混合液推平，後用蓋玻片覆蓋並用顯微鏡觀察

我很醜，都是因為我的隊友~~

革蘭氏染色 Gram's staining

第一步初染劑（Primary Stain）：使用結晶紫染色，染色部位主要為染細胞壁上的肽聚醣。

第二步媒染劑（Mordant）：加入稱革蘭氏碘液（Gram's Iodine）後會形成不溶性的結晶紫-碘（CV-I）複合體。細菌呈紫黑色。第二步是關鍵，它的目的是分辨細菌的革蘭氏染色特性。若為革蘭氏陽性菌，此複合體係結合於細胞壁之鎂、核糖核酸（Magnesium Ribonucletic Acid），形成鎂-核糖核酸-結晶紫-碘（Mg-RNA-CV-I）複合體，不易脫去。

第三步脫色劑（Decoloring Agent）：使用酒精（95%）脫色，試劑具脂溶劑（Lipid Solvent）和蛋白脫水劑（Protein Dehydrating Agent）之雙重功能。此步驟對革蘭氏陽性細菌無效，因為細胞壁上厚厚的細胞壁(成分為肽聚醣)阻隔了結晶紫-碘複合體的外滲，只能留在細菌體內。革蘭氏陰性菌細胞壁層薄，會被脫色而成為無色。

第四步複染劑（Counterstain）：為了對比，在此之後會加入Safranin進行複染，革蘭氏陰性菌成紅色，而革蘭氏陽性菌仍保有原來的紫色。

E. coli染色結果

S.A.染色結果