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Artículo

Potencial antifúngico de extractos de cuatro especies vegetales sobre el crecimiento de Colletotrichum gloeosporioides en papaya (Carica papaya) en poscosecha

Antifungal potential of extracts from four vegetables species on the growth of Colletotrichum gloeosporioides in postharvest papaya (Carica papaya)

Nadia Landero Valenzuela¹*, Daniel Nieto Ángel¹, Daniel Téliz Ortiz¹, Raquel Alatorre Rosas¹, Mario Orozco Santos², Carlos Fredy Ortiz García³

¹Colegio de Postgraduados, Campus Montecillo. Carretera Texcoco-México, km 36.5, Montecillo, Texcoco, México. E-correos: nadialv@hotmail.com, dnieto@colpos.mx, dteliz@colpos.mx, alatoros@colpos.mx

²Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias (INIFAP). Carretera Colima-Manzanillo, km. 35, Colonia Predio La Escondida, Tecomán, C. P. 28930, Colima, Colima, México. E-correo: orozco.mario@inifap.gob.mx

³Colegio de Postgraduados, Campus Tabasco. Periférico Carlos A. Molina, s/n, Carretera Cárdenas-Huimanguillo, km 3, Cárdenas, Tabasco, México. E-correo: cfortiz@colpos.mx

*Autora para correspondencia: landerovn@colpos.mx

Aceptado 24-Mayo-2013

Resumen

El manejo de antracnosis por Colletotrichum gloeosporioides es el problema más importante en poscosecha de frutos tropicales. La actividad antifúngica de diferentes extractos vegetales fue evaluada in vitro e in vivo para controlar la antracnosis poscosecha en papaya. Extractos de ajo (Allium sativum) (10 y 15 %) y canela (Cinnamomum zeylanicum) (0,0050; 0,0100; 0,0150 %) mostraron efecto fungicida en contra de C. gloeosporioides para supresión de crecimiento micelial (100 %), inhibición de germinación (100 %) y esporulación del hongo (100 %), considerándose estos extractos como los más promisorios para inhibir el desarrollo del hongo in vitro. Estudios in vivo también revelaron que los extracto de ajo (11,74 %) y canela a dosis de 0,0054 % aplicada antes y al mismo tiempo de la inoculación con C. gloeosporioides, fueron las dosis óptimas para el control (severidad) de la antracnosis en frutos de papaya artificialmente inoculados, mientras que a mayores dosis la severidad aumentó. La variable fitotoxicidad arrojó resultados consistentes con lo anterior, comprobándose que al aumentar las dosis de extracto de canela se presentó cambio de color en los frutos. Los resultados sugieren la posibilidad de usar estos extractos a dosis adecuadas como biofungicidas para controlar antracnosis en papaya en poscosecha.

Palabras claves: ajo, canela, crecimiento micelial, fungicidas, in vitro e in vivo, limón, neem.

Abstract

Management of anthracnose caused by Colletotrichum gloeosporioides is the most important issue for the tropical fruit postharvest. Antifungal activity of several plant extracts was evaluated in vitro and in vivo for controlling postharvest anthracnose of papaya. Garlic (10 and 15 %) and cinnamon (0,0050, 0,0100, 0,0150 %) extracts showed fungicidal effect against C. gloeosporioides in suppressing the mycelial growth (100 %), and spore germination and sporulation inhibition (100 %), being these extracts the most promising for inhibiting in vivo fungal growth. In vivo studies also revealed that garlic extracts (11,74 %) and cinnamon (0,0054 %) were applied before and the same time of the inoculation of C. gloeosporioides, these were optimal dose for anthracnose control (severity) on artificially inoculated papaya fruits. Phytotoxicity variable showed results consistent with the above, and found that increasing the dose of cinnamon extract was color change on the fruits. These results suggest the possibility of using these extracts in suitable doses as biofungicides for control postharvest papaya anthracnose.

Key words: cinnamon, fungal growth, fungicides, garlic, in vitro and in vivo, lemon, neem.

INTRODUCCIÓN

El fruto de papaya (Carica papaya) es muy susceptible a diversas enfermedades ocasionadas por hongos durante la poscosecha como son Cladosporiumsp., Fusarium sp., Alternaria sp., Rhizopus sp. (Cappellini, 1988; Vásquez-López et al., 2012), Phomopsis sp., Botriodiplodia y Colletotrichum gloeosporioides, siendo este el más importante ocasionando elevadas pérdidas que han sido informadas desde un 1 % hasta un 93 % (Paull et al., 1997).

En México, el control de la antracnosis causada por Colletotrichum gloeosporioides se logra a través de fungicidas (Benomilo y Tiabendazol) (Sanders et al., 2000; Tavares y de Souza, 2005; Liberato y Tatagiba, 2001). El uso continuo de estos compuestos trae consigo el desarrollo de resistencia en algunos microorganismos, por lo que se vuelven obsoletos, tal es el caso de Benomilo (Liberato y Tatagiba, 2001) y Tiabendazol (Gutiérrez-Alonso, J. G. et al., 2003; Gutiérrez-Alonso, O. y Gutiérrez-Alonso, J. G. 2003) que ya no presenta efectividad o es muy baja en el control del hongo Colletotrichum gloeosporioides. Además, el uso de estos agentes en poscosecha se ha visto restringido debido a la posibilidad de que los seres humanos estén sometidos a una exposición directa a estos compuestos químicos y a los riesgos que esto implica (Tripathi y Dubey, 2004). Por otro lado, el consumo de frutas frescas se ha incrementado debido al conocimiento público de que éstas contienen una gran cantidad de nutrimentos que ayudan a mantener la salud en los seres humanos (Spadaro y Gullino, 2004). Debido a lo anterior es necesario contar con alternativas que permitan reducir la cantidad de compuestos fungicidas que se aplican a las frutas en poscosecha.

Las alternativas de control para Colletotrichum gloeosporioides y otras especies son variadas. Entre las principales se encuentran el uso de aire caliente (Coates et al., 1993), tratamientos hidrotérmicos (Prusky et al., 1999), atmósferas modificadas (Karabulut y Baykal, 2004), luz ultravioleta (Stevens et al., 1997), microorganismos como agentes de control biológico (Janisiewicz y Korsten, 2002; Spadaro y Gullino, 2004) y extractos de plantas (Bautista-Baños et al., 2003).

Una de las alternativas que se han estudiado con resultados prometedores, se basa en el hecho que las plantas elaboran metabolitos secundarios, con la finalidad de disminuir el ataque de parásitos y depredadores naturales, muchos de estos compuestos se caracterizan por ser inocuos para el ser humano, y se consideran como “fungicidas naturales” (Hopkins, 1999).

El objetivo del presente trabajo fue determinar la actividad antifúngica in vitro e in vivo de diferentes extractos vegetales como control de Colletotrichum gloeosporioides en frutos de papaya en poscosecha.

MATERIALES Y MÉTODOS

Origen de los aislamientos

Se seleccionaron frutos de papaya (Carica papaya) en etapa de madurez de consumo, con uniformidad en apariencia y tamaño, con síntomas de “antracnosis” provenientes de Oaxaca y Veracruz; 2 de los estados con las mayores producciones a nivel nacional de esta especie vegetal (SIAP, 2011); estos fueron obtenidos de la Central de Abasto de la Ciudad de México. Los frutos fueron procesados en el Laboratorio de Enfermedades de Frutos en Postcosecha del Colegio de Postgraduados.

Aislamientos, identificación y prueba de patogenicidad de Colletotrichum gloeosporioides

Una vez en el laboratorio, se tomaron fragmentos del tejido enfermo de un tamaño aproximado de 5 x 5 mm, tratando de involucrar tejido infectado (20 %) y tejido sano (80 %); posterior a esto se sembraron en cajas de Petri con Agar Papa Dextrosa (PDA) y se incubaron a temperatura ambiental (26 ± 2 ºC) durante 10 días. Posteriormente, una porción de tejido micelial se transfirió a otra caja de Petri con PDA con la finalidad de obtener cepas puras esporuladas. Una vez confirmada la identidad de C. gloeosporioides, usando claves taxonómicas para identificación de hongos de Sutton (1980) se obtuvieron 7 cepas plurispóricas (PVC16, PVC20, PVC28, PVC36, OC5, OC8 y OC14). Artificialmente se inocularon frutos sanos de papaya, a las heridas de 2 mm de diámetro x 2 mm de profundidad causadas por mondadientes de madera previamente esterilizados, se les agregaron 20 μL de esporas del patógeno a concentración de 1x10⁶; lo anterior para reproducir la sintomatología y realizar nuevamente el aislamiento, con el fin de corroborar la patogenicidad de C. gloeosporioides según los Postulados de Koch (Agrios, 1995). Junto a este procedimiento se agregaron frutos testigos, a los cuales se les colocó PDA sin el hongo. Con la finalidad de evitar pérdida de patogenicidad del organismo se mantuvo una cepa madre, de la cual se obtuvo el micelio para inocular frutos sanos de papaya y hacer reaislamientos los cuales fueron empleados para los bioensayos. Además del uso de claves morfológicas, la identificación del patógeno se confirmó mediante análisis moleculares.

El método de extracción se adecuó de acuerdo a lo descrito por Doyle y Doyle (1990). Para la amplificación de la extracción por PCR (‘Polymerase Chain Reaction’), las regiones ITS-5,8s fueron amplificadas con los iniciadores universales ITS2 e ITS5. Las reacciones de PCR se realizaron en volúmenes de reacción de 25 μL. La amplificación se llevó a cabo en un termociclador C-1000 Touch^TM (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA) con el siguiente programa: 4 min a 95 ºC, seguido de 35 ciclos de 1 min a 95 ºC, 2 min a 52 ºC, 1 min a 72 ºC, y por último 10 min a 70 ºC. Los productos de PCR obtenidos se observaron mediante electroforesis en gel de agarosa al 1 % teñido con bromuro de etidio (0,2 μg/μL); los resultados observados se documentaron a través de fotografías para posteriormente ser analizados. La secuenciación del ADN se realizó con 2 iniciadores (ITS2 e ITS5) en ambas direcciones para asegurarse de que no había lectura errónea. Los productos de PCR fueron purificados y secuenciados por el Laboratorio Nacional de Biotecnología Agrícola, Médica y Ambiental (LAMBAMA) del Instituto Potosino de Investigación Científica y Tecnológica (IPICYT), México. Las secuencias se compararon con las registradas en la base de datos GenBank® (National Institutes of Health (NIH), Bethesda, MD, USA).

Obtención de extractos vegetales crudos

Las diferentes especies vegetales empleadas para los procedimientos de extracción fueron recolectadas de diversos lugares. Las hojas y frutos de limón (Citrus lemon (L.) Burm. f.) fueron proporcionados por una huerta ubicada en el Municipio de Tecomán, Colima, por otro lado, el ajo (Allium sativumL.) al igual que la corteza de canela (Cinnamomum zeylanicum) se obtuvieron del Mercado San Antonio, del Municipio de Texcoco, Estado de México. Por último, el polvo de neem (Azadirachta indica) fue proporcionado por el Laboratorio de Entomología del Colegio de Postgraduados en el Estado de México.

Extracto de ajo (Allium sativum L.)

Semillas de ajo (600 g) se colocaron en 600 mL de etanol al 99 %. Se licuó hasta que estuvo totalmente licuado, se permitió un reposo de 24 horas, y se filtró a través de un paño de tela previamente esterilizado. Posteriormente se concentró bajo flama directa hasta que todo el etanol fue evaporado (6 horas). El extracto así obtenido se resuspendió en 200 mL de agua destilada estéril (Wagner y Bladt, 1996).

Extracto de hojas, semillas y cáscara de limón (Citrus lemon (L.) Burm. f.)

Se recolectaron hojas y frutos de limón, de estos últimos se utilizaron las semillas y la cáscara. Las semillas al igual que la cáscara fueron lavadas con agua corriente hasta eliminar impurezas y residuos. Se pesaron por separado las semillas (30 g de 3 kg de frutos de limón) y la cáscara (365 g de 3 kg de frutos de limón). Las primeras fueron maceradas y colocadas en un frasco de vidrio, posteriormente se agregó éter de petróleo de tal manera que cubriera a las mismas; se dejó en reposo durante 3 días. Pasado este tiempo el extracto fue filtrado, se dejó evaporar el solvente, para lo cual fue necesario mantenerlo bajo agitación, se llevó a sequedad el extracto, resuspendiéndolo en 250 mL de agua con Tween 20®, considerándose lo anterior como el extracto al 100 %. Lo anterior se guardó en refrigeración a 10 ºC para su posterior uso en los bioensayos (Manici et al., 1997). Para obtener los extractos de cáscara y hojas de limón se repitió todo el procedimiento a excepción de la maceración.

Extracto de canela (Cinnamomum zeylanicum)

Se pesaron 50 g de corteza de canela, que se mezcló con 200 mL de agua destilada. Esto fue calentado a 100 ºC por 2 h. Para extraer el aceite esencial de la fase acuosa se emplearon 200 mL de éter de petróleo 3 veces. Posteriormente se concentró a temperatura ambiental (26 ± 2 ºC). El extracto volátil resultante se mantuvo a 10 ºC hasta su uso para los bioensayos (Wang et al., 2009).

Extracto de neem (Azadirachta indica)

Para realizar la extracción se empleó metanol. Polvo de semilla de neem se colocó en un frasco al cual previamente se le vaciaron 600 mL de metanol y se dejó en reposo durante 48 h. La mezcla obtenida fue filtrada usando un paño de algodón previamente esterilizado. El filtrado se concentró por agitación a temperatura ambiental (26 ± 2 ºC), para lograr una mezcla homogénea se resuspendió en agua destilada estéril con Tween 20®, considerándose lo anterior como el extracto al 100 % (Kosma et al., 2011).

Control de C. gloeosporioides in vitro utilizando extractos vegetales

Se preparó medio de cultivo (PDA), el cual se mezcló antes de su solidificación con cada una de las concentraciones ensayadas de los diferentes extractos vegetales (en 100 mL de PDA se agregó el porcentaje correspondiente) (Cuadro 1) y se vació en cajas de Petri marcadas con anterioridad. En cada placa se colocó en el centro de la misma un disco de PDA con micelio de cada una de las cepas recolectadas de C. gloeosporioides de 5 mm de diámetro. En total se utilizaron 23 tratamientos (Cuadro 1); cada uno constó de 3 repeticiones. El testigo químico para esta prueba fue Imazalil, el cual se preparó a 500 ppm.

Crecimiento micelial

Se midió cada 24 h el diámetro ecuatorial (en mm) en las cajas Petri con PDA en el cual los hongos crecieron, para ello se usó un vernier digital hasta que en el testigo absoluto cubrió totalmente la superficie del medio de cultivo.

Germinación de esporas

Para determinar el efecto de los extractos sobre la capacidad de las esporas para germinar se utilizaron recipientes translúcidos con capacidad de 300 µL y se colocaron 150 µL de medio de cultivo PDA. Antes de que el medio de cultivo solidificara se mezcló con la cantidad necesaria de extractos vegetales hasta lograr concentraciones indicadas en el Cuadro 1. Posteriormente se colocaron 20 µL de una suspensión previamente preparada a concentración de 1x10⁶ esporas por mL (20.000 esporas). Se evaluó la germinación a las 5, 10 y 15 h (datos son adimensionales, ya que fueron obtenidos del análisis del área bajo la curva del progreso del porcentaje de germinación) empleando un microscopio compuesto AO® MicroStar®, 1130 (American Optical Scientific Instruments, Buffalo, NY, USA - Reichert^TM, Inc., Depew, NY, USA) (Gutiérrez-Alonso, 2001). Una espora fue considerada germinada cuando el largo de su tubo germinativo alcanzó la mitad del diámetro de la espora (Plascencia-Jatomea et al., 2003).

Esporulación

A los 10 días, cuando el hongo logró su esporulación total se determinó la concentración de conidios. Para recolectarlos, cada caja de Petri con los diferentes tratamientos, fueron enjuagadas con agua destilada estéril, la superficie fue raspada con una varilla de vidrio y filtrada a través de una malla de algodón estéril. Alícuotas de 0,5 mL de cada suspensión con conidios fueron transferidas a una cámara de Newbauer para realizar el recuento de los conidios (datos presentados son dados en medias de números de esporas).

Control de C. gloeosporioides in vivo en frutos de papaya utilizando extractos crudos vegetales

Se utilizaron frutos de papaya (variedad Maradol) los cuales se conservaron bajo condiciones de laboratorio; estos fueron obtenidos de un productor con un manejo adecuado del cultivo en el Estado de Oaxaca, México. Se seleccionaron frutos sanos sin daños físicos o signos y síntomas aparentes de la enfermedad. De las 7 cepas obtenidas se seleccionó la más patogénica para llevar a cabo las pruebas (OC14); la selección se realizó obteniendo después de previa prueba que todos los aislamientos presentaron un desarrollo morfológico similar, además de que en pruebas in vitro todos mostraron resistencia a Benomilo.

Cada fruto fue desinfestado con hipoclorito de sodio al 2 % durante 3 minutos, frotándolos suavemente para evitar dañar el exocarpio; posteriormente se enjuagaron con agua destilada estéril y se dejaron secar a temperatura ambiental sobre papel secante. De manera paralela se preparó una solución de esporas de C. gloeosporioides a concentración de 1x10⁶, y extractos de canela a 0,00264; 0,0054; 0,012; 0,020 y 0,030 %, asimismo se prepararon las dosis para los extractos de ajo (5,87; 11,74; 17,61; 23,48 y 29,35 %).

Las diferentes concentraciones de extractos de canela ensayadas fueron asperjadas sobre 15 frutos (cinco concentraciones con tres repeticiones) 24 h antes de la inoculación con C. gloeosporioides, al mismo tiempo que la inoculación y 24 horas después de la inoculación, tres bloques fueron formados con 15 frutos cada uno. La combinación de los diferentes tiempos transcurridos entre la aplicación del extracto a diferentes dosis y la inoculación generó 15 tratamientos, un testigo químico y uno absoluto.

La inoculación se realizó haciendo heridas sobre el exocarpio de los frutos con palillos de madera estéril de 2 mm de profundidad, sobre dicha herida se colocó con micropipeta una suspensión de esporas previamente preparada a concentración de 1x10⁶ conidios/mL. El efecto de los extractos fue comparado con el efecto de un fungicida comercial (Imazalil). Posteriormente los frutos se colocaron en cámara húmeda (recipientes plásticos cubiertos con bolsas del mismo material, para evitar la pérdida de humedad) a temperatura de 26 ± 2 ºC. Las variables fueron medidas cada 24 h.

Severidad

La severidad del daño ocasionado por la antracnosis en la superficie de los frutos se midió diariamente por medio del diámetro de la lesión característica de antracnosis (datos analizados arrojaron valores en unidades adimensionales debido a que se aplicó el área bajo la curva del progreso de la enfermedad), a partir del punto de inoculación.

Fitotoxicidad

Se determinó mediante los cambios de color en los frutos tratados en relación con los testigos, para lo cual se utilizaron imágenes digitales de los frutos tratados con extractos vegetales. Para la digitalización se utilizó una cámara Kodak EasyShare Z712 IS de 7,1 megapíxeles (Eastman Kodak Company, Rochester, NY, USA). Las fotografías se tomaron en tamaño de 1024 x 768 píxeles a distancia de 1 metro, iluminadas con una lámpara fluorescente de 20 w. El ángulo entre la lente de la cámara y la fuente de la iluminación fue de aproximadamente 45º. La apertura del diafragma utilizada fue f/2,8 y la velocidad del obturador de 1/30 s manteniendo estos parámetros constantes. Las imágenes fueron guardadas en un formato tipo JPEG. Se obtuvieron las medias de RGB (red, green, blue), que en conjunto conforman el color real del fruto de papaya, mediante el software Adobe® Photoshop® CS5, actualización 12.0.4 (Adobe System Incorporated, San José, California, USA) que fueron analizadas estadísticamente. Los valores más cercanos a los obtenidos para el testigo absoluto correspondieron a la coloración normalmente exigida en los mercados para la especie y variedad. Se analizaron imágenes de 40 x 40 píxeles por cada tratamiento (Lúquez-Bibiloni y Aguilera-Radic, 2005).

Análisis estadístico

Los datos obtenidos fueron sometidos a pruebas de normalidad (Shapiro Wilk) y homostacidad (Barret), los datos que no cumplieron con estos supuestos (esporulación) fueron transformados mediante la fórmula x = y^1/2; donde x = dato transformado, y = concentración de esporas. Para facilitar la interpretación de los resultados, éstos se mostraron en sus valores reales (sin transformar). De igual manera se realizaron análisis de varianza y pruebas de separación múltiple de medias (Tukey, α = 0,05) así como análisis de regresión lineal para determinar la concentración (in vitro) y dosis (in vivo) letal 50 (CL₅₀) con la ayuda de comando Solver de Microsoft® Office Excel, versión 2007 (Microsoft® Corporation, Redmond, WA, USA). Se calculó la curva del progreso de la enfermedad por medio del método de los polígonos, y las áreas resultantes fueron sometidas a análisis de varianza y a pruebas de separación de medias mediante el programa Statistical Analysis System, versión 9 para Windows (SAS Institute Inc., Cary, NC, USA).

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Pruebas in vitro

Efecto de los extractos de ajo y limón

Con relación al crecimiento micelial de las cepas de Veracruz y de Oaxaca se observaron diferencias estadísticas altamente significativas entre los aislamientos donde se empleó extracto de ajo (p < 0,0001), y a excepción del tratamiento al 5 % en todos los demás no hubo desarrollo de micelio. Los tratamientos en donde se utilizaron los extractos con algún órgano o parte de limón también presentaron diferencias estadísticas altamente significativas (p < 0,0001), pero hubo desarrollo del hongo; en general, las concentraciones más altas correspondieron con un menor crecimiento micelial para estos extractos (Cuadro 2). El ajo en concentraciones de 10 y 15 % igualó el efecto del testigo químico en la concentración utilizada (500 ppm). La DL₅₀ más baja (2,37 %) correspondió al ajo, mientras que la más alta (18,4 %) fue para los tratamientos con hoja de limón. Debido a que en los tratamientos con semilla de limón no hubo diferencias estadísticas significativas (p > 0,05) no se pudo determinar la DL₅₀.

Baños-Guevara et al.(2004) realizaron un estudio similar, en donde se emplearon 17 diferentes extractos vegetales, dentro de ellos, ajo, con el cual se mostró una inhibición del crecimiento micelial de C. gloeosporioides de 54,34 %, seguido por la hierba santa (Piper auritum) con un 48,82 %. Asimismo, Bosquez-Molina et al. (2010), con extracto de tomillo y limón mexicano sobre C. gloeosporioides y Rhizopus stolonifer en papaya, obtuvieron los mejores resultados con el primero, ya que a una concentración de 0,06 % no se presentó crecimiento micelial, mientras que con aceite de limón mexicano se requirió de 0,085 % para lograr el mismo resultado. En el presente trabajo ni aún a la mayor concentración (15 %) se logró inhibir completamente el crecimiento micelial, obteniéndose una DL₅₀ de 16,34 %.

Los aislamientos de C. gloeosporioides provenientes de los estados de Veracruz y Oaxaca mostraron valores de germinación diferentes en función de las concentraciones evaluadas; en las de 10 y 15 % el extracto de ajo inhibió por completo la germinación de las esporas, seguida, en efectividad, por 5 % para el mismo extracto (p < 0,0001). En relación al limón, para cáscara las concentraciones mayores correspondieron con una menor germinación (Cuadro 2).

Por otro lado, respecto a la esporulación de los aislamientos, hubo diferencias estadísticas altamente significativas (p < 0,0001) entre tratamientos para las diferentes concentraciones de extracto de ajo, presentándose la menor esporulación a concentraciones de 10 y 15 %. Para el caso del limón, las concentraciones de extractos de las distintas partes u órganos no produjeron un efecto significativo (p > 0,05).

La actividad inhibitoria de compuestos de ajo ha sido ampliamente investigada. Benkeblia (2004), encontró que el ajo tiene un efecto inhibitorio antifúngico muy marcado a medida que se aumentan las concentraciones (50 mL-500 mL/1000 mL) sobre Penicillium cyclopium y Fusarium oxysporum. Kyung et al. (2002) también informaron que la alicina, compuesto azufrado del extracto de ajo mostró actividad antibacterial en contra deStaphylococcus aureus B33.

Efecto del extracto de canela

Para los tratamientos in vitro con canela, se presentaron diferencias estadísticas altamente significativas (p < 0,0001). En las concentraciones desde 0,0050 hasta 0,0150 % no se observó crecimiento del hongo igualando lo anterior al testigo químico; mientras que el mayor desarrollo fue para la concentración de 0,0005 %. Caso similar fue para la variable esporulación, en donde la diferencia estadística significativa marcó el mayor número de esporas para la concentración de 0,0005 % y la menor para los tratamientos de 0,0050; 0,0100 y 0,0150 % al igual que el testigo químico (Cuadro 3). Los resultados en un estudio realizado por Maqbool et al. (2011) fueron similares, al encontrarse que con la aplicación de aceite de canela a concentración de 0,4 % no se presentó crecimiento micelial de C. gloeosporioides y C. musae, comparado con goma arábiga y aceite de limoncillo (Cymbopogon citratus). Asimismo, encontraron que la germinación de C. gloeosporioides fue inhibida en un 49,5 % con aceite de canela al 0,4 %, mientras que cuando estuvo combinado con goma arábiga la inhibición fue del 85 %. Este efecto inhibitorio pudo estar relacionado con el componente eugenol, que se encuentra en mayor porcentaje en esta especie (81,2 %) (Combrinck et al., 2011). Por su parte, otro autor encontró este componente en un porcentaje de 74,92 % (Tzortzakis, 2009). El cinamaldehído también es considerado como uno de los componentes de la canela con actividad antifúngica, por ejemplo, Sivakumar et al. (2002) demostraron que este compuesto a 30 ppm inhibió la germinación conidial y el crecimiento micelial de Botryodiplodia theobromae, C. gloeosporioides y Gliocephalotrichum microchlamydosporum.

Efecto del extracto de semillas de neem

Los tratamientos en los que se evaluó el extracto de neem resultaron en diferencias estadísticas altamente significativas (p < 0,0001) con respecto a los controles. Encontrándose el menor valor cuando se empleó la concentración de 0,0300 % para crecimiento micelial y 0,1200 % para germinación, con respecto a las demás concentraciones las cuales fueron mayores (Cuadro 4). La esporulación no fue posible llevarla a cabo debido a que los tratamientos con este extracto no lograron purificarse por lo que estaban contaminados con bacterias dando como resultado que estos no esporularan. Los resultados anteriores discreparon de los encontrados por Amadioha (2000), quien mencionó que extracto de semillas de neem inhibió el crecimiento del patógeno Pyricularia oryzae en medio de cultivo, reduciendo el crecimiento radial en un 83,6 %, siendo comparable a un testigo comercial (Carbendazim 0,1 %); también difirieron de los obtenidos por Niaz et al. (2008) y Wang et al. (2010); esta diferencia en los resultados podría atribuirse a los diferentes métodos de extracción. Por ejemplo, diferentes solventes usados para la extracción pueden resultar en diferentes niveles de actividad antifúngica in vitro, como también, los extractos crudos de distintas especies de plantas pueden exhibir diferentes niveles de actividad en contra de C. gloeosporioides (Bussaman et al., 2012). Incluso extractos de semillas de neem recolectadas de distintas localidades pueden presentar diferentes propiedades antifúngicas (Niaz et al., 2008).

Pruebas in vivo

Severidad y fitotoxicidad

Las pruebas in vivo para el extracto de ajo en relación a la severidad, mostraron diferencias estadísticas altamente significativas entre tratamientos (p = 0,0012). La concentración de 11,74 % arrojó el menor desarrollo del hongo en la herida en los frutos, mejorando el resultado obtenido con el testigo químico, mientras que para los demás tratamientos se obtuvo un grupo homogéneo (Cuadro 5).

De manera contrastante al comportamiento in vitro, las dosis más altas de extracto de ajo no mostraron un mayor control sobre C. gloeosporioides, por el contrario, la severidad se incrementó con dosis más altas. Lo anterior podría deberse a un posible fenómeno de toxicidad en el fruto que tendría como consecuencia el incremento de la severidad de la enfermedad, lo cual es consistente con el trabajo de Zoffoli et al. (2008), que señalan la aparición de un desorden en frutos de uva tratados con compuestos azufrados. En los frutos de ajo se han encontrado compuestos que contienen azufre (Ichikawa et al., 2006), por lo cual es posible que estos causen eventualmente alguna fitotoxicidad a dosis elevadas. Sin embargo, dicho fenómeno no se manifestó en el color del fruto (Cuadro 6) ni se ha señalado en la producción de gas etileno, maduración o firmeza que se han publicado en trabajos similares (Baños-Guevara et al., 2004), por lo cual es necesario estudiar los cambios bioquímicos que sufre el fruto después de la aplicación de extractos de ajo.

Los datos de severidad en los frutos tratados con extractos de canela mostraron diferencias estadísticas altamente significativas entre tratamientos (p < 0,0001). El menor promedio de severidad se observó en el tiempo 2 (aplicación de canela e inoculación de esporas de C. gloeosporioides al mismo tiempo) con la dosis 0,0054 % (T2_D54), así como en el tiempo 1 (aplicación de canela 24 h antes de la inoculación de esporas de C. gloeosporioides) con la dosis 0,012 % (T1_D120), mientras que la media de severidad más grande fue para el tratamiento de tiempo 3 (aplicación de canela 24 h después de la inoculación de esporas C. gloeosporioides) con una dosis de 0,030 % (T3_D300), superando al testigo absoluto (Cuadro 5).

El fenómeno anterior indicó que la efectividad de los extractos de canela se incrementa si estos son aplicados antes de la llegada de las esporas a la superficie del fruto. La dosis de 0,020 y 0,030 % mostraron los valores de severidad más altos, y en estas mismas dosis también se pudo apreciar una alteración en los valores medios de RGB (Cuadro 6), lo cual indicó que esas dosis podrían tener un efecto perjudicial sobre la fisiología del fruto ocasionando un incremento en la severidad de la enfermedad, lo cual se vio soportado por las diferencias de color observadas en los frutos tratados con esas mismas dosis.

Maqbool et al. (2011) encontró diferentes efectos fungicidas al aplicar aceite de canela comparado con limoncillo, goma arábiga y sus combinaciones sobre C. gloeosporioides en papaya. Con canela a concentración de 0,4 % combinado con goma arábiga 10 %, se obtuvo el más alto efecto fungicida, retardando la aparición de los síntomas además de que se mantuvo la calidad de los frutos durante almacenamiento (13 ºC, 80 % HR). Los síntomas se presentaron levemente después de mantenerse las papayas 5 días a temperatura 25 ºC (60 % HR).

CONCLUSIONES

Los extractos ensayados mostraron efectividad en contra del patógeno en los análisis in vitro. Sin embargo, en los resultados in vivo dosis elevadas mostraron un incremento en la severidad de la enfermedad. Se observó que a dosis adecuadas, el uso de extractos de ajo y canela son una alternativa viable para el control de Colletotrichum gloeosporioides en frutos de papaya en poscosecha.

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

Agrios, G.N. 1995. Fitopatología. (2da. ed.) México: Editorial Limusa. 838 p.

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