Volumen 2 - Número 2
RVCTA
Revista Venezolana de Ciencia y Tecnología de Alimentos. 2 (2): 313-320. Julio-Diciembre, 2011
http://www.rvcta.org
ISSN: 2218-4384 (versión en línea)
© Asociación RVCTA, 2011. RIF: J-29910863-4. Depósito Legal: ppi201002CA3536.
Comunicación
Antimicrobial effect of ethanolic extracts from basil (Ocimum basilicum L.) on growth of Staphylococcus aureus
Universidad de Oriente, Núcleo Monagas, Escuela de Zootecnia, 1Departamento de Tecnología de Alimentos y 2Departamento de Biología y Sanidad Animal. Maturín, C. P. 6201, Estado Monagas, Venezuela
*Autor para correspondencia: juliocolivet@gmail.com
Aceptado 03-Enero-2012
Resumen
La albahaca (Ocimum basilicum L.) es una planta herbácea de la familia de las labiadas (Lamiaceae), muy común en Venezuela. En la presente investigación se evaluó la supervivencia de una cepa de Staphylococcus aureus por la acción antimicrobiana de extractos etanólicos de albahaca fresca y seca. Las muestras frescas fueron sometidas a homogeneización en licuadora. Para la obtención de las muestras secas se utilizó una estufa convencional a temperatura de 55 ºC x 28 horas. Los extractos se obtuvieron por destilación a presión reducida, temperatura de 45 ºC y empleando etanol como solvente. Posteriormente, se emplearon en medios de cultivo contentivos de S. aureus y se monitoreó el crecimiento del microorganismo en el tiempo, obteniéndose los parámetros de crecimiento a través del modelo de Baranyi y Roberts (1994). Los extractos frescos y secos produjeron efecto antimicrobiano sobre S. aureus a concentraciones de 5 y 10 %, afectando los parámetros de crecimiento de la bacteria, presentando diferencias estadísticamente significativas (p < 0,05) con respecto al grupo control.
Palabras claves: albahaca, efecto antimicrobiano, Ocimum basilicum L., S. aureus, supervivencia.
Abstract
Basil (Ocimum basilicum L.) is a herbaceous plant of the Labiatae family (Lamiaceae), common in Venezuela. In the present study, the survival of a Staphylococcus aureus strain by the antimicrobial action of ethanolic extracts from fresh and dehydrated basil was evaluated. Fresh samples were subjected to homogenization in a blender. To obtain dehydrated samples a conventional oven was used (55 ºC x 28 hours). The extracts were obtained by distillation under reduced pressure, temperature 45 °C, using ethanol as a solvent. Subsequently were used in culture media containing S. aureus and the growth of the microorganism over time was monitored. Growth parameters were obtained through the Baranyi and Roberts (1994) model. The extracts produced antimicrobial effect on S. aureus at concentrations of 5 and 10 %, affecting the growth parameters of the bacteria and showing statistically significant differences (p < 0,05) in comparison to control.
Key words: antimicrobial effect, basil, Ocimum basilicum L., Staphylococcus aureus, survival.
INTRODUCCIÓN
El potencial antimicrobiano y antioxidante de extractos y aceites esenciales de plantas aromáticas y medicinales, con el fin de utilizarlos en el control de patógenos causantes de enfermedades en humanos, animales y vegetales, así como conservantes en alimentos con ventajas sobre los aditivos sintéticos, referente a efectos tóxicos y genotóxicos colaterales, favorables económica y medioambientalmente, se ha convertido en la razón de ser de muchas investigaciones recientes (Fernández-L. et al., 2007). En este sentido, la búsqueda de sustancias con efecto antimicrobiano en fuentes no tradicionales, como las plantas superiores, es importante para mejorar la calidad de los alimentos (Acosta et al., 2003).
El género Ocimum está representado por más de 150 especies y tiene una amplia distribución geográfica en las regiones de clima tropical y subtropical. En Venezuela se conocen 21 géneros de la familia Lamiaceae (Labiatae), con aproximadamente 80 especies distribuidas en todo el territorio nacional (Velázquez, 1997). Son un grupo importante de plantas aromáticas que contienen aceites esenciales ricos en diferentes constituyentes, tales como linalol, geraniol, citral, alcanfor, eugenol y timol, entre otros y representan un inmenso valor para la industria de perfumería, cosméticos, alimentaria y la farmacéutica (Sánchez-Govín et al., 2000). Su acción farmacológica se define como antiinflamatoria, antiséptica, antiespasmódica y analgésica. Es utilizado en medicina tradicional para tratar afecciones respiratorias, gastrointestinales y reumatismo. Tópicamente es usado en baños para tratar afecciones de la piel y se ha comprobado actividad antimicótica in vitro (Chalala et al., 2002).
El objetivo de este trabajo fue evaluar el efecto antimicrobiano de extractos etanólicos de albahaca (Ocimum basilicum L.), fresca y seca, sobre el crecimiento de Staphylococcus aureus.
MATERIALES Y MÉTODOS
Obtención de la muestra de Ocimum basilicum L.
Muestras de plantas de albahaca fueron adquiridas en el Mercado Municipal de la ciudad de Maturín (Monagas, Venezuela) y transportadas al Laboratorio de Usos Múltiples del Programa de Tecnología de Alimentos, Escuela de Zootecnia de la Universidad de Oriente. Previa selección, se desecharon todas aquellas con daños o síntomas de plagas o enfermedades y se almacenaron por un periodo corto de tiempo (2 h máximo) a temperatura de 5 ºC.
Obtención de los extractos
Preparación del extracto de albahaca fresca
Muestras de plantas de albahaca frescas fueron lavadas con abundante agua potable y secadas con papel absorbente. Posteriormente se tomaron 40 g de muestra y se les agregó 150 mL de solvente etanol. Se homogenizó en licuadora y se dejó en reposo a temperatura de 26 ºC por 48 horas.
Preparación del extracto de albahaca seca
Los extractos de albahaca seca se obtuvieron siguiendo la técnica descrita por Márquez-Vizcaíno et al. (2007). Las plantas de albahaca (hojas y tallos) se lavaron con agua corriente y destilada. Se secaron e introdujeron en bolsas de papel perforadas para luego colocar en estufa por convección PDI System, modelo M120-VN (MPM Instruments s.r.l., Bernareggio, Milano, Italia) a 55 ºC por 28 horas. Una vez secas se picaron en una picadora comercial (Moulinex) y el picado (pulverizado) se almacenó por 7 días aproximadamente en frascos color ámbar para su uso posterior. Se pesaron 40 g de muestra en una balanza analítica previamente calibrada y se colocaron en un beaker de 500 mL con 150 mL de etanol para diluir la muestra dejándola en reposo a 26 ºC por 48 horas. Seguidamente, los extractos se filtraron a través de un embudo de filtración rápida para separar la parte vegetativa de la solución, la cual se concentró en un rotavapor BÜCHI, modelo R-210 Basic (BÜCHI Labortechnik AG, Suiza) a presión reducida, temperatura 45 ºC y 200 rpm.
Técnica de cultivo empleada para el efecto inhibitorio de extractos de albahaca fresca y albahaca seca
Origen de la cepa e inoculación del microorganismo
La cepa fue provista por el Cepario del Laboratorio de Microbiología de la Escuela de Zootecnia de la Universidad de Oriente, Núcleo Monagas, Venezuela.
La inoculación de S. aureus se realizó de acuerdo a lo estipulado por Acero-Ortega et al. (2005), con algunas modificaciones. Inicialmente, de una concentración conocida del microorganismo (103 UFC/mL), se tomaron alícuotas de 1 mL del cultivo y se añadieron a fiolas contentivas de 99 mL de caldo infusión cerebro-corazón (BHI, ‘Brain Heart Infusion’) en concentraciones de 0,5 y 10 % de los extractos de albahaca fresca y seca por separado. Posteriormente los medios de cultivo inoculados fueron sometidos a incubación en un baño de agua termostatado a temperatura de 37 ºC.
Determinación del crecimiento de Staphylococcus aureus
La población de S. aureus se determinó siguiendo la metodología descrita por Harley y Prescott (2002). El crecimiento se midió después de inocular el microorganismo, cada 30 minutos. Para ello se realizaron diluciones seriadas utilizando como diluyente solución buffer fosfato (PBS, ‘Phosphate Buffered Saline’) y luego se tomaron alícuotas de las diluciones y se añadieron a placas de Petri con agar nutritivo (45 ºC); se aplicó y se dejó solidificar. Posteriormente, se incubaron a 37 ºC por 24 horas. Se contaron las células viables y se multiplicó por su factor de dilución.
Construcción de la curva de crecimiento de Staphylococcus aureus
Los datos obtenidos fueron convertidos a log10 (N), donde N representa la población de S. aureus en un tiempo dado (UFC/mL). Se construyó una gráfica donde el eje de las abscisas se encontraba representado por el tiempo de incubación y el eje de las ordenadas por el crecimiento microbiano en un tiempo dado.
Análisis estadístico
El estudio fue realizado por triplicado. El conteo de colonias fue convertido a log10 UFC/mL y los datos se procesaron usando el software estadístico SAS/STAT®, versión 8.0 (SAS Institute Inc., Cary, NC, USA). Las variables independientes fueron representadas por el efecto del secado en la obtención de los extractos, la concentración y el tiempo de incubación. Las diferencias de las medias fueron separadas a través del procedimiento de la Mínima Diferencia Significativa (MDS) con un nivel de significancia del 5 %.
El conteo de S. aureus fue modelado en función del tiempo usando el modelo de Baranyi y Roberts (1994). Para la construcción de la curva se usó el programa DMFit (Institute of Food Research, Norwich, UK). El modelo de Baranyi y Roberts es una ecuación diferencial de primer orden no autónomo y separable (Baranyi et al., 1993). El modelo contiene cuatro parámetros: un parámetro representado por la fase lag; μ, la tasa de crecimiento exponencial (log10 UFC/mL/h); y0, que representa la asíntota inferior de la curva de crecimiento bacteriano (log10 UFC/mL); y ymáx, que representa la asíntota superior de la curva de crecimiento (log10 UFC/mL). Dos parámetros adicionales (m y n) son incluidos en el modelo de Baranyi y Roberts correspondientes al desarrollo de la curva de crecimiento en las regiones de transición (de la fase lag a exponencial y de la exponencial a la estacionaria). La tasa de crecimiento exponencial obtenida de la curva fue transformada a tasa máxima de crecimiento específico, μmáx (h-1) por multiplicación de μ con el ln(10) (Barmpalia et al., 2005).
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Efecto inhibitorio de extractos de albahaca fresca y seca sobre el crecimiento de Staphylococcus aureus
Los medios de cultivo sin extracto de albahaca soportaron un rápido y prolífico crecimiento de S. aureus. La población del microorganismo excedió 4,8 log10 UFC/mL en un tiempo de 4,5 h (Fig. 1). La incorporación de extractos de albahaca fresca y seca en los medios de cultivo tuvo un efecto estadísticamente significativo sobre la inhibición del crecimiento de S. aureus (p ≤ 0,05), notándose que los extractos más efectivos fueron los que se encontraban a concentraciones del 10 %. Este comportamiento pudo deberse, según refiere la literatura, a que los extractos de albahaca poseen compuestos con propiedades antimicrobianas, principalmente debido a la presencia de altas concentraciones de linalol (Hanif et al., 2011) cuyos valores pueden alcanzar 69,3 % del total de la composición química de sus aceites esenciales (Soković et al., 2010).
Figura 1.- Efecto inhibitorio de extractos de albahaca fresca y seca sobre el crecimiento de Staphylococcus aureus.
Estos resultados fueron similares a los efectos bacteriostáticos informados por Moghaddam et al. (2011) para Ocimum basilicum, por Nwinyi et al. (2009) para Ocimum gratissimum y para Ocimum sanctum por Joshi et al. (2009) y Mishra y Mishra (2011), quienes encontraron actividad antimicrobiana de extractos y aceites esenciales de Ocimum sobre el crecimiento de S. aureus.
Aunado a esto también se estudió el efecto de los tratamientos sobre los parámetros de crecimiento derivados del modelo de Baranyi y Roberts (1994) para S. aureus (tiempo de latencia, tasa máxima de crecimiento y máxima densidad poblacional), notándose un efecto significativo de éstos en las variables de respuestas. El tiempo de latencia (lag) más prolongado (3,04 h) se obtuvo con la concentración más alta de extractos de AF-10 %, diferenciándose del resto. Sin embargo, la máxima velocidad de crecimiento (µmáx) se obtuvo en los extractos de AF-5 y AF-10 % con valores de 3,47 y 3,49 h-1, respectivamente. Mientras, la máxima densidad poblacional (ymáx) fue de 5,08 en cultivos sin extractos (Cuadro 1). El comportamiento de este microorganismo ante la presencia de los extractos de albahaca fue el de prolongar el tiempo de latencia hasta la adaptación a tales condiciones, para luego compensar su crecimiento con una mayor velocidad, no obstante la máxima densidad poblacional fue alcanzada en aquellos medios sin extracto. Se resalta claramente el efecto inhibitorio de la albahaca en el crecimiento de S. aureus. Es de hacer notar que la pérdida de agua de las plantas provoca la volatilización o cambia las propiedades de los compuestos químicos responsables de retrasar el tiempo de adaptación del microorganismo al medio de crecimiento.
Cuadro 1.- Parámetros de crecimiento de S. aureus derivados del modelo de Baranyi y Roberts (1994).*
El efecto antimicrobiano de los extractos de albahaca fue menor al obtenido por López-Pantoja et al. (2007), quienes en la aplicación de extractos etanólicos, acetónicos y metanólicos de semillas de neem (Azadirachta indica A. Juss.) y venadillo (Swietenia humilis Zucc.) a concentraciones del 10 % lograron reducir 5 log10 UFC/mL de la concentración inicial de S. aureus (8 log10 UFC/mL). En tal sentido, los extractos de albahaca generaron un efecto bacteriostático sobre S. aureus, permitiendo el crecimiento del microorganismo hasta un máximo de 3,958 log10 UFC/mL (AS-5 %), en contraste con aquellos donde no se aplicó extractos de albahaca al medio de crecimiento alcanzando valores máximos de 5,081 log10 UFC/mL. Los resultados obtenidos fueron similares a los informados por Park (1997), quien indicó mayor tiempo de latencia y menor densidad poblacional para Escherichia coliempleando extractos de Pimenta dioica al 2,0 %.
CONCLUSIONES
La incorporación de extractos de albahaca fresca y seca en los medios de cultivo representan una alternativa viable para inhibir el crecimiento de S. aureus.
Los tiempos de latencia de S. aureus fueron mayores cuando se incorporaba extractos de albahaca fresca y estos fueron proporcionales a la concentración del extracto.
La máxima densidad poblacional fue afectada por los extractos de albahaca, encontrándose valores menores cuando las concentraciones fueron superiores al 5 % de extracto, sin diferencias entre los extractos de albahaca fresca y seca.
AGRADECIMIENTOS
Se agradece al Ministerio del Poder Popular para Ciencia, Tecnología e Industrias Intermedias (MCTI) a través de la Fundación para el Desarrollo de la Ciencia y la Tecnología en el Estado Monagas (FUNDACITE - Monagas) por haber financiado la investigación.
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