什麼是微生物?

五大類微生物:細菌、原生生物、藻類、病毒、真菌

健康人身上的正常Microbiota

1.皮膚:G+菌,包括葡萄球菌和桿菌

2.呼吸道:葡萄球菌、鏈球菌、類白喉桿菌

3.胃:乳桿菌

4.小腸:鏈球菌、乳桿菌

5.大腸:兼氧性好氧菌(如大腸桿菌和糞鏈球菌)和厭氧菌(如梭狀芽孢桿菌)

6.生殖泌尿道:男性為厭氧G-菌,女性則還有乳桿菌、酵母菌、鏈球菌、大腸桿菌等

微生物培養方式

微生物培養實驗器具

微生物培養實驗步驟

菌落懸浮法

1.用酒精燈將接種環滅菌

2.將接種環從母菌盤上取出單一菌落

3.將沾到的菌落打入LB培養液,混合均勻

4.在37°C 震盪培養箱中培養16小時,隔天觀察細菌菌落的形成

稀釋塗抹法(Dilution Spreading Method)

1.以微量吸管吸取0.1 mL之大腸桿菌稀釋菌液,滴在LB plate上面

2.取三角玻棒,先放置於95％酒精燒杯中,取出過火使酒精燃盡,等待一下使其冷卻

3.右手持三角玻棒,左手則旋轉LB plate,將稀釋菌液均勻分布在LB plate上

4.將菌盤倒放,置於37°C培養箱內培養,隔天觀察細菌菌落的形成

分區劃線法(Streaking Method)

1.以滅菌接種環挑取大腸桿菌單一菌落

2.在LB plate上平行劃線(分三區),劃完一區轉90度後再劃下一區,最後一區要把線條拉開

3.將菌盤倒放,並於37°C培養,可得到分散的單一菌落(single colony)

細菌生長控制

影響細菌生長的因素:

1.溫度:影響酵素活性

2.紫外光:誘發雙嘧啶聚合物產生

3.含氧量:影響酵素活性

4.化學物質:例如抗生素，不同抗生素作用原理不同,例如:

• 阻礙細胞壁合成，導致細菌脹破死亡，例如β-內醯胺類抗生素。

• 增強細胞膜通透性、打開離子通道，例如多粘菌素和短桿菌肽等。

• 抑制細菌核糖體合成蛋白質，例如四環素類、大環內酯類、氨基糖苷類、氯黴素等。

• 阻礙細菌DNA複製和轉錄，導致細菌繁殖或合成蛋白質受阻，例如喹諾酮類。

參考資料:https://reurl.cc/5o5eXz

• 抗生素或市售消毒產品感受性實驗:

1. 準備大腸桿菌未稀釋菌液一管，並取一個LB plate，以簽字筆標示不同化學藥劑

2. 吸取0.1毫升菌液加入plate，以三角玻棒均勻塗抹

3. 將鑷子過火，夾取Ampicillin圓形濾紙貼上plate，之後在過火，依序貼上四片無菌圓形濾紙

4. 每片濾紙個別加入10 μL蒜頭萃取液、 95% 酒精、10% 漂白水、無菌水(對照組)

5. 注意每用一次鑷子後都要過火，且各紙錠保持一定距離

6. 各菌盤正放，置於37°C培養，隔天觀察並測量抑菌圈直徑大小並記錄

實驗結果:

1.紫外光照射

2.抗生素或市售消毒產品感受性實驗

抑菌圈的測量:

(1)抑菌圈直徑大於12mm，代表無抗生素活性。

(2)抑菌圈直徑介於12-16mm，代表有中度抗生素活性。

(3)抑菌圈直徑大於16mm，代表有高度抗生素活性。

微生物染色方法

簡單染色:

• 原理:因細菌核酸與細胞壁部分帶負電，易與帶正電結晶紫染料結合。

• 步驟:

1. 先在乾淨玻片中央置入5 μL無菌水，以Tip輕沾培養基上E.coli菌落(不用太多)，與水混勻後，畫圓圈方式將菌液塗抹成一薄層，最後以簽字筆註明菌名。

2. 熱固定:以鑷子夾住玻片一端，快速通過火焰3-4次。

3. 在染槽中將結晶紫2-3滴在玻片上，靜置1分鐘。

4. 以蒸餾水洗滌瓶沖掉過剩染液，注意玻片應與水流平行，避免直接沖菌造成流失。

5. 以吸水紙吸乾玻片，蓋上蓋玻片後用顯微鏡觀察和拍照。

6. 以100倍油鏡觀察。

負染:

• 原理:因酸性染劑帶負電而無法染帶負電之菌體，所以染色時在細胞周圍形成沈澱，將菌體和背景區分。此法優點是不用熱固定，細胞不會變形，可看到正常大小和型態，而且可以觀察不易染色之細菌，例如螺旋菌。

• 步驟:

1. 取一滴苯胺黑(nigrosin)染劑，滴於載玻片一端。

2. 以tip取培養基上E.coli菌體，置於染劑中混勻。

3. 用另一乾淨玻片，一端置於苯胺黑色液之前，呈30度角，向另一端推去，使其成一薄膜，樣品由濃漸淡，而玻片要置於空氣中乾燥。

4. 蓋玻片覆蓋在顏色較淡處，並以顯微鏡觀察並拍照。

革蘭氏染色:

• 原理:前面已經介紹，在此不贅述

• 步驟:

1. 將大腸桿菌及枯草桿菌固定於載玻片上。

2. 玻片放在染缸中的架子上，先以2%結晶紫染色，靜置10秒鐘。以蒸餾水輕洗。

3. 加入革蘭氏碘液媒染劑(Mordant)，靜置10秒鐘。以蒸餾水輕洗。

4. 以95%酒精脫色，切忌脫色過度，逐滴滴下，至發現結晶紫未釋出後即可。以蒸餾水輕洗。

5. 以番紅複染10秒。以蒸餾水輕洗。

6. 以吸水紙吸乾玻片，蓋上蓋玻片後用顯微鏡觀察和拍照。

7. 低倍鏡找到菌體後再逐漸加大倍率，最後用油鏡觀察。

同場加映其他染色法:

• 莢膜染色:莢膜是細菌分泌的膠狀物，附於細胞壁外，但非所有細菌都有。莢膜可避免被吞噬，故含厚莢膜之細菌通常會致病。菌液不宜加熱，因細胞收縮於菌體周圍所形成之清晰環，易誤認為莢膜。

1.初染劑:結晶紫，將菌體與莢膜均染成藍紫色。

2.脫色與複染劑:硫酸銅，因莢膜經初染後結晶紫僅附著，可被水洗掉，故以硫酸銅除去過剩初染液與莢膜顏色。且其同時為複染劑，將莢膜染成淡藍色，而菌體為深紫色。

• 內孢子染色:厭氧之梭狀芽胞桿菌屬與好氧之桿菌屬，有兩種狀態:代謝旺盛之生長型細胞和代謝停止之內孢子。當環境不利生長型細胞時，產生內孢子，外有緻密殼保護。由於殼的複雜構造及化學組成，所以對不利環境有抵抗力。遇有利環境條件時，內孢子可萌芽恢復為生長型細胞。此外要注意內孢子形成與萌芽並非生殖。

1.初染劑:孔雀石綠，因內孢子殼不易吸收初染劑，故需加熱促進滲透。此時生長型細胞與內孢子均呈綠色。

2.脫色劑:蒸餾水，因內孢子染色後不被蒸餾水脫色，可除去過剩初染劑。而生長型細胞經水脫色後呈無色。

3.複染劑:番紅，經脫色之生長型細胞，可吸收複染劑而變成紅色，芽胞則保留初染之綠色。

• 抗酸性染色: 分支桿菌屬（Mycobacterium）之細菌需抗酸性染色才能觀察。此屬中常見者如結核桿菌與痲瘋桿菌為人類之致病菌，其細胞壁含厚層臘質，染料不易滲透。但只要滲透，就很難被酸性酒精脫色，因此稱為抗酸菌。

1.初染劑:石炭酸複紅，使染料溶於細胞壁之脂質並滲透而變紅，加熱有助於滲透作用。齊耳-倪耳生二氏法之改良法不需加熱，只要加入潮濕劑降低細胞壁與染色液間的表面張力，就可將菌染成紅色。

2.脫色劑:酸性酒精（3%HCl+95%乙醇）。因初染劑較脫色劑更易溶於臘質，故抗酸性菌不被脫色，保留初染劑而成紅色，非抗酸性菌因缺乏臘質，脫色時呈無色。

3.複染劑:甲烯藍，染脫色細胞，因只有非抗酸性菌脫色，故可吸收複染劑而成藍色，抗酸性菌則保留初染之紅色。

資料來源:東吳大學微生物學系網站

討論:

1.細胞壁構造如何影響革蘭氏染色結果?

答:G+細菌細胞壁有較厚肽聚醣，脂質含量較少，脫色時會脫水而使CV-I複合物無法溶出，保持紫色。G-細菌細胞壁則富含LPS，肽聚醣層較薄，脫色時脂質被乙醇溶解形成大孔，使CV-I複合物容易釋出，使菌體之後可被番紅染成紅色。

2.革蘭氏染色最重要步驟為何?有沒有其他注意事項?

答:脫色是最重要步驟。脫色過度會使初染流失，使革蘭氏陽性菌成革蘭氏陰性菌。但脫色不足會無法完全除去CV-I複合物，使革蘭氏陰性菌成革蘭氏陽性菌。而菌體宜使用未超過24小時之新鮮培養，因菌齡老化使革蘭氏陽性菌無法保留初染，而顯示出錯誤結果。