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PRIMERA VISITA
En este protocolo de laboratorio llevamos a cabo la PREPARACIÓN DE BACTERIAS con el objetivo de hacerlas COMPETENTES, es decir, capaces de incorporar ADN externo en futuros experimentos.
Para ello, inicialmente cultivamos las bacterias en un medio nutritivo adecuado para favorecer su crecimiento y multiplicación. Una vez alcanzada la fase óptima de crecimiento, se sometieron a diferentes pasos de tratamiento que permiten acondicionar su membrana celular y facilitar posteriormente la entrada de material genético.
Durante el proceso se trabajó en condiciones estériles para evitar contaminaciones y aplicamos diferentes técnicas de laboratorio para preparar las células. Finalmente, las bacterias ya preparadas se conservaron a baja temperatura para mantener su viabilidad y poder utilizarlas más adelante en otros experimentos.
SEGUNDA VISITA
El protocolo que realizamos en esta sesión fue la TRANSFORMACIÓN BACTERIANA POR CHOQUE TÉRMICO:
La transformación bacteriana permite introducir material genético (plásmidos) dentro de una bacteria para que adquiera una nueva característica. Las bacterias en su estado normal no permiten la entrada de ADN externo, pero con este protocolo se vuelven temporalmente competentes, es decir, capaces de captar el ADN del medio.
Los genes que nos interesan introducir son un gen que aumenta su expresión en presencia del lindano y un gen de fosforescencia. Además, añadimos un gen de resistencia a antibióticos para que cuando lo cultivemos en las placas de medio de cultivo, solo crezcan las que han adquirido el gen.
También realizamos un choque térmico por calor. El rápido aumento de temperatura produce poros temporales en la membrana celular a través de los cuales entra el plásmido al citoplasma.
En el choque térmico por frío, la rápida exposición a frío sella y estabiliza la membrana.
Después, añadimos el medio SOC, un medio de cultivo rico en nutrientes que permite que las bacterias se recuperen del estrés del choque térmico y comiencen a expresar los genes del plásmido introducido.
Finalmente, incubamos las muestras a la temperatura óptima para el crecimiento de las bacterias E. coli. Además, la agitación asegura una buena aireación (necesaria para el metabolismo) y distribución uniforme de nutrientes. Este paso es crucial para que las bacterias transformadas expresen el gen de resistencia al antibiótico del plásmido.
TERCERA VISITA
En esta sesión, realizamos una PCR DE COLONIA BACTERIANA
En esta sesión, realizamos una PCR DE COLONIA BACTERIANA
¿QUE ES UNA PCR?
La reacción en cadena de la Polimerasa, es una tecnica que sirve para copiar muchas veces un fragmento concreto de ADN. Usamos esto ya que el ADN de partida es una colonia (agrupación de bacterias) que suele estar en cantidades pequeñas. Por ello generamos muchas copias del ADN de partida y asi lo amplificamos. Para más tarde poder comprobar la presencia de un gen.
FASES DE UNA PCR
FASES DE UNA PCR
REALIZADA EN UN TERMOCICLADOR
1-DESNATURALIZACIÓNEl ADN se calienta y se separa en sus dos cadenas.
2-ALINEAMIENTO: Se unen los cebadores a la parte del ADN que queremos copiar.
3-EXTENSIÓN: La enzima (ADN polimerasa) copia el fragmento de ADN.
Se repite el proceso, hasta obtener muchas copias del fragmento deseado.
PREPARACÍON
PREPARACÍON
Hacemos una PCR de colonia, es un tipo de PCR que se realiza sobre una colonia de bacterias que crecen en la placa.
Utilizamos 5 TUBOS PCR
Control negativo (agua miliQ)
Control positivo (complemento Anabaena=cianobacterias)
3 tubos de colonias
OBJETIVO: Comprobar si una colonia de bacterias tiene el plásmido correcto.
CUARTA VISITA
En esta práctica de laboratorio aprendimos cómo extraer ADN de bacterias y comprobar si la extracción había salido bien.
Primero separamos las bacterias del líquido de cultivo y usamos distintas soluciones para abrirlas y liberar el ADN. Después lo limpiamos y lo recogimos en un tubo para medir su concentración.
Más tarde preparamos un gel de agarosa y colocamos en él las muestras de ADN para observar cómo se desplazaban con la corriente eléctrica. Esta técnica se conoce como ELECTROFORESIS EN GEL DE AGAR. Gracias a esto pudimos comparar los fragmentos obtenidos y comprobar el resultado del experimento de una forma visual y práctica.
Soluciones
Soluciones
Gel agar en la carga eléctrica
Gel agar en la carga eléctrica
Resultados electroforesis
Resultados electroforesis
QUINTA VISITA
En esta sesión cultivamos cianobacterias Anabaena modificadas genéticamente para que produzcan fluorescencia y puedan detectar lindano en el agua. Trabajamos en condiciones totalmente estériles dentro de una campana de flujo laminar, desinfectando todo el material con etanol y luz ultravioleta.
Cianobacterias Anabaena
Campana de flujo laminar
Cianobacterias en proceso de conjugación
Cultivos de cianobacterias en medio mínimo y medio LB
Sembramos las cianobacterias en dos tipos de medios: uno mínimo, donde las bacterias tienen que crecer haciendo la fotosíntesis, y otro medio LB que sirve para detectar si hay bacterias contaminantes creciendo. También trabajamos tanto con cianobacterias normales (Wild Type) como con otras que ya habían incorporado el plásmido modificado mediante conjugación bacteriana. Hicimos todos los cultivos por triplicado y esperamos unas semanas para ver los resultados.
CONJUGACIÓN BACTERIANA
CONJUGACIÓN BACTERIANA
La conjugación bacteriana es un mecanismo de transferencia genética mediante el cual una bacteria transmite material genético a otra a través de un contacto directo entre ambas. Normalmente, este material se encuentra en un plásmido, una pequeña molécula de ADN independiente.
En nuestro caso, las bacterias portadoras del plásmido transfieren ese ADN a las cianobacterias Anabaena, permitiendo que estas adquieran nuevas características, como fluorescencia y resistencia a antibióticos.
RESULTADOS:
RESULTADOS:
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