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"Obiettivo finale del progetto è ottenere materiale, protocolli e geni
per migliorare la tolleranza ai patogeni fungini e/o ai cambiamenti climatici
di almeno quattro varietà di vite (Aglianico, Fiano, Falanghina e Greco)."
OR 1 - Produzione di callo embriogenico di quattro cultivar campane (Aglianico, Fiano, Falanghina, Greco)
OR 1 - Produzione di callo embriogenico di quattro cultivar campane (Aglianico, Fiano, Falanghina, Greco)
La produzione di callo embriogenico è il primo passo necessario per poter migliorare le varietà di vite tramite le TEA e il materiale di partenza per la sua produzione sono le infiorescenze di vite. Per ogni varietà la procedura dovrà essere adattata sia in termini di terreno di induzione e crescita che di miscela ormonale.
OR2 - Adattamento di protocolli di gene editing alle varietà di interesse
Questa attività prevede i seguenti passaggi: i) purificazione di protoplasti vitali da callo embriogenico; ii) trasferimento del complesso CRISPR-Cas (per gene editing) e del gene di interesse (per la cis-genesi) nei protoplasti; iii) rigenerazione a pianta dei protoplasti trasfettati. Tutti e tre i passaggi ed in particolare lo step di rigenerazione potrebbero richiedere delle messe a punto nel protocollo che permettano una buona riuscita nella specifica varietà. E’ noto ad esempio che vi sono varietà più recalcitranti rispetto ad altre nella capacità rigenerativa.
OR3 - Studio di possibili geni target
Una delle limitazioni attuali all’utilizzo su ampia scala delle TEA è la scarsa disponibilità di geni da impiegare come target. Questa situazione è dovuta sia alla scarsa conoscenza che abbiamo riguardo alla funzione dei geni di vite nella fisiologia della pianta, sia al fatto che target ideali per l’applicazione di queste tecnologie sono tratti fenotipici con base mono- o oligo-genica. Per trovare nuovi potenziali target genici coinvolti nella tolleranza agli agenti patogeni o allo stress da siccità e alle variazioni dei processi metabolici della maturazione, è quindi necessario rifarsi alla letteratura o a conoscenze pregresse sviluppate nei nostri laboratori per poi verificarne la funzione in pianta. A tal fine, all'inizio del progetto trasformeremo una varietà modello di vite con un set di geni potenzialmente coinvolti nella tolleranza a stress biotici e abiotici per studiare la loro funzione nella pianta. Questa conoscenza sarà poi utile per essere trasferita anche nelle quattro varietà di interesse, utilizzando i protocolli messi a punto nel corso di questo progetto.
OR4 - Sequenziamento dei genomi delle varietà di interesse ed analisi via sequenziamento delle linee mutate
Il sequenziamento dei genomi ha visto recentemente un ulteriore sviluppo legato alla disponibilità di tecnologie che permettono di ottenere sequenze di elevata qualità e lunghezza. Il risultato finale è l’assemblaggio di genomi con risoluzione cromosomica che permettono di rilevare tutti i tipi di varianti strutturali. Nel progetto intendiamo utilizzare questa tecnologia per caratterizzare le varietà di interesse e alcune linee mutate ottenute tramite gene editing e cisgenesi della varietà modello e se disponibili delle varietà considerate. Nel caso delle piante editate l’analisi prevede di caratterizzare la sequenza del gene target o del sito di inserzione del cis-gene, ma anche di individuare off-targets ed eventuali variazioni genetiche indotte dalla coltura in vitro e dal processo di embriogenesi somatica. Nel caso delle varietà di interesse si vuole ottenere un assemblaggio di elevata qualità in termini di completezza e di accuratezza.
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