JKA microarray project

１　研究の概要

JKA補助事業にて平成30年度～令和2年度に渡りご支援を頂いた「糖タンパク質自動合成マイクロアレイシステム」にて実績のある、相互作用分子の検出と提示分子の構造の違いによる機能変化の並列観測システムに分子異方性を評価可能な観測システムを追加し、糖質を介した界面分子機能に関しその異方性と運動能を標的とした観察系のステップアップを行った。

２　研究の目的と背景

近年、自動運転における利用を目的として高機能化と低価格化が顕著に進行している計測システム基盤を活用し、通常の相互作用量評価に加え、計測対象分子の配向性と自由度を標的とした並列評価機能付加へのステップアップを実現する。

このステップアップに伴い、従来のDNAまたはタンパク質マイクロアレイでは重視されなかった、糖質自体の異方性および糖質とそのリガンド（ウイルス・細菌を含む）との相互作用において重要となるクラスター効果に伴いもたらされる特徴的なリガンドの異方性と自由度までを並列比較評価できる実験系を実現する。

３　研究内容

（１）糖質アレイ界面の異方性計測モバイルシステム開発

光学系の異方性を安定化させるため、カメラ固定場、レンズ焦点調整システム、およびアレイスライド観察場までを一体化したシステム開発を実施した。また、カメラの超高感度化に伴い、従来の非観察領域の開放系では迷光によるノイズが無視できないほど増大することが確認されたためシステム全体を再設計し、迷光ノイズを遮断可能な閉鎖形、溶液交換作業可能な部分開放形へと自在に変更可能なシステムを構築した。

（２）界面リアルタイム蛍光偏光計測システムの試作

偏光カメラと温度可変ステージによる界面分子の動態観察系を構築し、さらに産業カメラメーカーが提供するソフト開発キットを用いアレイ場の分子配向性を並列リアルタイム比較解析が可能な計測システムを構築した。

４　本研究が実社会にどう活かされるか―展望

　本研究により開発した分子場の配向性のリアルタイム並列比較計測システムは、これまでの糖質研究で蓄積された細胞界面や組織界面で生じる生命現象を新たな視点で解明する基盤技術となることが期待される。特に、代表者が近年注力している生命現象と連動した糖鎖型（グリコタイプ）の分類同定技術であるグリコタイピングに分子異方性という新たな「型」の比較同定技術を追加できることが期待される。糖質はその不斉点蓄積と、その鎖状構造の配向性より感染、疾患、シグナル伝達の場として高度に利用されている。本研究成果はその基礎的機能の解明から、診断、創薬までの基盤技術となることが期待される。とくに、本事業で開発した小型高感度マイクロアレイ計測システムと組み合わせることにより、場所と時間の制限を超えた糖質が織りなす配向場計測技術の社会実装と利用が期待される。

５　教歴・研究歴の流れにおける今回研究の位置づけ

　代表研究者はこれまで一貫して細胞表層や生体高分子表面の糖質を対象とした特徴的分子構造とその機能を同定する技術（グリコタイピング）研究を実施してきた。本事業で構築した表面分子異方性計測システムは、還元末端を細胞表面側に非還元末端を細胞外にて維持する、という本質的な異方性を有する糖質の機能をより深く探求するための基盤技術となることが期待される。特に、ＪＫＡ事業を通じて開発してきたマイクロアレイシステムに本事業では異方性観察およびその変化のリアルタイム計測システム追加実装することに成功した。本研究はこれまで培った糖質分子設計と分子構造同定技術にその相互作用のダイナミズム計測を実装し、感染症、免疫、分か等の表面相互作用とその変化を特徴とする生命現象の解明と応用に貢献することが期待される。

６　本研究にかかわる知財・発表論文等

該当なし

７　補助事業に係る成果物

（１）補助事業により作成したもの

https://sites.google.com/eis.hokudai.ac.jp/hinou/jka-microarray-project

（２）（１）以外で当事業において作成したもの

該当なし

８　事業内容についての問い合わせ先

所属機関名：　北海道大学　（ホッカイドウダイガク）

住　　　所：　〒001-0021

札幌市北区北21条西11丁目

担　当　者：　教授　　比能　洋（ヒノウヒロシ）

担当部署：　大学院先端生命科学研究院

（ダイガクインセンタンセイメイカガクケンキュウイン）

E-mail：　hinou@sci.hokudai.ac.jp

ＵＲＬ：　https://sites.google.com/eis.hokudai.ac.jp/hinou

１　研究の概要

　糖タンパク質を提示しその糖鎖修飾と糖鎖機能の観測を同一環境で実施可能な自動合成マイクロアレイシステムの開発と評価を実施した。

２　研究の目的と背景

　ヒトを含む真核生物において細胞外に分泌されるたんぱく質は小胞体とゴルジ装置を経由して生産・分泌されており、その多くはこの小胞体およびゴルジ装置にて糖鎖修飾をうけた糖タンパク質である。実際に、近年のバイオ医薬の躍進の主役は糖タンパク質製剤であり、近年は低分子医薬のジェネリック医薬品に相当する後発バイオ医薬品（バイオシミラー）が製造・流通するようになった。一方、糖タンパク質の糖鎖はタンパク質本体の体内動態の制御因子であり、その構造制御はその機能解明と「活性に再現性のある」バイオ医薬品開発において鍵となるが、その厳密な制御は極めて困難であり、実際のタンパク質製剤においても大きな分散性を有する。本研究では糖タンパク質の糖鎖修飾と糖鎖機能の観測同一環境で実施可能な自動合成マイクロアレイシステムを開発し、「単一な」糖鎖構造を有する糖タンパク質の調性とその機能解析を同一場で実施可能なシステムの開発を目指すものである。

　本研究ではその場としてマイクロアレイスライド等の固体表面を選択し、市販の糖タンパク質や無細胞合成系で作成した糖タンパク質モデルを用いてその表面での糖鎖構造変換や糖鎖構造解析、そして機能解析を可能とするための基盤技術群の構築を目的としている。

３　研究内容

（１）　マルチカラー型小型・超小型マイクロアレイ観察装置の開発

　先行事業で開発したマイクロアレイ観察環境を活用し、スマートホンなどのモバイル端末で利用可能なマルチカラー型マイクロアレイ観察装置を開発した。CADソフトと３Dプリンター技術を用いて設計・出力した観察部を交換ユニット化することにより、FITC等の青色光励起蛍光分子、Cy3等の緑色光励起型蛍光分子、Cy5等の赤色光励起蛍光分子にそれぞれ対応可能なシステムへとアップデートした。今期はこのシステムの最適化を行った。緑色LEDと比較して青色および赤色LEDは出力の低いものが多く、LED波長およびフィルターを調整することにより、それぞれの検出系を再構築できた。本事業課題である糖鎖修飾の管理に特化した観察には蛍光標識標準タンパク質および蛍光標識レクチン等を用いてその識別パターンの調査を行った。

また、AIによる自動検出数値化に必要な機能が内蔵されており、マイクロアレイ上のコンテンツとソフトを連動して開発することにより感染症の遠隔・個別診断や等に即応可能である。また、マイクロアレイスポッターも３Dプリンター技術とオープンソースソフトを活用して自作した。

（２）糖タンパク質糖鎖構造の入れ替えに対応した観測・品質管理技術群の開発

　糖タンパク質上の糖鎖パターンが（１）で開発したマイクロアレイ解析装置で観測可能であることを実証した。しかし、その実証過程においてマイクロアレイシグナル変化と構造変化の相関を具体的に証明する必要があった。そこで、マイクロアレイに使用する超微量サンプル、p (10-12) mol ～f (10-15) mol、の構造解析が可能な質量分析技術の開発を行った。まずは糖タンパク質糖鎖のラベル化と高感度化を同時に実現可能なマトリックスの開発を行い、通常のマトリックスとサンプルの混合操作によってラベル化工程までが完了し、糖鎖解析用マトリックスとして広く普及しているDHBよりも2桁感度が高くなるマトリックスの開発に成功した。

　さらに、糖タンパク質のイオン化過程で糖鎖断片を生成させ、生じた糖鎖断片のみを選択的にイオン化するMALDI-TOFMS用マトリックスとその分析技術の開発に成功した。これまで糖鎖解析で一般的に使用されてきた、MALDI-TOFMS用マトリックスはペプチド解析用として開発・発見されたものを使用していたため、糖タンパク質を直接解析した際はペプチドが優先的にイオン化していた。このマトリックスはあまりにも一般的に普及してしまったため、糖鎖専用のマトリックス開発は限定的であった。これに対し我々はマイクロアレイ用糖鎖サンプルの品質管理、という特殊事情に対応するため、糖鎖選択的に高感度化可能なマトリックス、糖鎖選択的にラベル化可能なマトリックス、糖鎖選択的に断片化とイオン化を可能なマトリックスをそれぞれ世界で初めて開発することに成功した。この成功によりシグナル強度情報のみで判断する必要があったマイクロアレイ研究に、分子量情報という信頼性の高い情報を付加し、研究結果の信頼性の劇的な向上に成功した。　　

４　本研究が実社会にどう活かされるかー展望

　本事業で開発したモバイル型マイクロアレイシステムはスマートホンのからの電源供給で稼働可能であり、コロナ禍下など、高齢者など人の移動が困難な患者の遠隔・個別診断や、インフルエンザ感染が疑われる養鶏場や養豚場などにおけるオンサイト診断を実現が期待される。また、マイクロアレイによる超微量・超並列解析により、従来の感染機構解析およびリガンド・阻害剤（治療薬）候補の絞り込み工程の劇的な加速効果が期待される。COVID-19やCOVID-19の陰で史上最大の猛威を振るった家禽へのトリインフルエンザ感染、さらに今後出現する未知の感染症への迅速対策などへの活用が期待される。

５　教歴・研究歴の流れにおける今回研究の位置づけ

　研究代表者は糖質を標的とした合成と分析に関して20年以上の研究経歴を有し、特に複合糖質の迅速合成技術を基盤としたフォーカスドライブラリ構築技術に注力してきた。その評価系としてマイクロアレイと質量分析を活用しており、本事業は社会要請が強い糖タンパク質の構造制御と機能解析の加速を標的としたものである。特に2020年春からのCOVID-19の流行を受け、感染症対策技術としての開発へと舵を切っている。

６　本研究にかかわる知財・発表論文等

（知財）

発明者：比能 洋

出願人：北海道大学

特許出願PCT/JP2020/002624

「未修飾シアリル化複合糖質および糖ペプチドのリフレクトロンモードＭＡＬＤＩ－ＴＯＦおよびＴＯＦ／ＴＯＦ質量分析のためのアニリン誘導体またはアミノオキシ基含有芳香族誘導体／ＤＨＢ／アルカリ金属マトリックス組成物」

出願日：2020年（令和２年）1月24日

発明者：比能 洋

出願人：北海道大学

特願2021-000822

「ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦＭＳによる複合糖質高分子糖鎖の直接解析方法およびそれに用いるための固体マトリックス組成物」

出願日：2021年（令和3年）1月6日

（発表論文）

1)      Hiroshi Hinou, Seiya Kikuchi, Rika Ochi, Kota Igarashi, Wataru Takada, Shin-Ichiro Nishimura “Synthetic glycopeptides reveal specific binding pattern and conformational change at O-mannosylated position of α-dystroglycan by POMGnT1 catalyzed GlcNAc modification” Bioorganic&Medicinal Chemistry, 27, 2822-2831, 2019.

https://doi.org/10.1016/j.bmc.2019.05.008

2)      Iris A. Bermejo, Claudio D. Navo, Jorge Castro-López, Ana Guerreiro, Elena M. Sánchez Fernández, Fayna García-Martín, Hiroshi Hinou, Shin-Ichiro Nishimura, José M. García Fernández, Carmen Ortiz Mellet, Alberto Avenoza, Jesús H. Busto, Gonçalo J. L. Bernardes, Ramón Hurtado-Guerrero, Jesús M. Peregrina, and Francisco Corzana “Synthesis, Conformational Analysis and in vivo Assays of an Anti-cancer Vaccine that features an Unnatural Antigen based on a sp2-Iminosugar Fragment” Chemical Science 11, 3996-4006, 2020.

 https://doi.org/10.1039/C9SC06334J

3)      Hajime Wakui, Yoshikazu Tanaka, Toyoyuki Ose, Isamu Matsumoto, Koji Kato, Yao Min, Taro Tachibana, Masaharu Sato, Kentaro Naruchi, Fayna Garcia Martin, Hiroshi Hinou, Shin-Ichiro Nishimura “A Straightforward Approach to Antibodies Recognising Cancer Specific Glycopeptidic Neoepitopes”, Chemical Science 11, 4999-5006, 2020.

https://doi.org/10.1039/D0SC00317D

4)      Pablo A. Guillen-Poza, Elena Matilde Sanchez-Fernandez, Gerard Artigas, Jose Manuel Garcia Fernandez, Hiroshi Hinou, Carmen Ortiz Mellet, Shin-Ichiro Nishimura, Fayna Garcia-Martin “Amplified detection of breast cancer autoantibodies using MUC1-based Tn antigen mimics” Journal of Medicinal Chemistry 63, 7921-8650, 2020.

https://doi.org/10.1021/acs.jmedchem.0c00908

5)      Hiroshi Hinou “Aniline Derivative/DHB/Alkali Metal Matrices for Reflectron Mode MALDI-TOF and TOF/TOF MS Analysis of Unmodified Sialylated Oligosaccharides and Glycopeptides” International Journal of Mass Spectrometry 443, 109-115, 2019.

https://doi.org/10.1016/j.ijms.2019.06.006

７　補助事業に係る成果物

（１）補助事業により作成したもの

https://altair.sci.hokudai.ac.jp/g4/JKAproject/JKA2019.htm　(URL)

（２）（１）以外で当事業において作成したもの

特になし　(URL)

８　事業内容についての問い合わせ先

所属機関名：　北海道大学　（ホッカイドウダイガク）

住　　　所：　〒001-0021

札幌市北区北21条西11丁目

担　当　者：　教授　　比能　洋（ヒノウヒロシ）

担当部署：　大学院先端生命科学研究院

（ダイガクインセンタンセイメイカガクケンキュウイン）

E-mail：　hinou@sci.hokudai.ac.jp

ＵＲＬ：　http://altair.sci.hokudai.ac.jp/g4/

本研究にかかわる知財・発表論文等

（知財）

特願 2019-011457, 発明者：比能 洋, 出願人：北海道大学

「未修飾シアリル化複合糖質および糖ペプチドのリフレクトロンモードＭＡＬＤＩ－ＴＯＦおよびＴＯＦ／ＴＯＦ質量分析のためのアニリン誘導体／ＤＨＢ／アルカリ金属マトリックス組成物」

北海道大学研究シーズ集　https://seeds.mcip.hokudai.ac.jp/jp/view/381/

（発表論文）

Hinou H,,* Kikuchi S., Ochi R., Igarashi K., Takada W., Nishimura S.-I. “Synthetic glycopeptides reveal specific binding pattern and conformational change at O-mannosylated position of α-dystroglycan by POMGnT1 catalyzed GlcNAc modification” Bioorganic&Medicinal Chemistry, 27, 2822-2831 (2019).

DOI: org/10.1016/j.bmc.2019.05.008

Hinou H.* “Aniline Derivative/DHB/Alkali Metal Matrices for Reflectron Mode MALDI-TOF and TOF/TOF MS Analysis of Unmodified Sialylated Oligosaccharides and Glycopeptides” Int. J. Mass Specytom., 443, 109-115 (2019).

DOI: org/10.1016/j.ijms.2019.06.006

（外部発表）

1)       Hiroshi Hinou “Novel matrix system for reflectron mode MALDI-TOF and TOF/TOF MS analysis of unmodified sialylated oligosaccharides and glycopeptides” Japanese-American Symposium on Applied & Translational Glycosciences, ACS Fall 2019 National Meeting, San Diego, August 27th, 2019.

2)       比能　洋「シアリル化糖鎖・複合糖質の直接MALDI-TOFMS解析法」日本化学会第８５春季年会、名古屋、2019年8月20日.

研究内容

（１）小型・超小型マイクロアレイ観察装置の開発

マイクロアレイ上にマイクロピペッターによる分注操作により溶液交換やラベル化操作可能なマイクロ流路環境と、その操作中でも継続してマイクロアレイ観察が可能な光路環境を両立させることにより、代表者らが蓄積した糖鎖自動合成などの糖鎖修飾操作と通常のマイクロアレイ計測に必要な相互作用解析実験操作を同一環境にて実施可能なシステムの構築を行った。導電性シリコンゴム、マイクロ流路、高輝度LED、CADソフト、および３Dプリンタなどを組み合わせることにより観察装置を独自設計することにより、汎用性が高く、小型化可能な反応・相互作用実験用流路と計測・解析実験用光路を併せ持つシステムの構築に成功した。産業用カメラや、天体観測用カメラを使用し、オープンソースソフトで解析しながら装置設計を試行錯誤した結果、ノートパソコンおよびスマートフォン等のモバイル機器からの電源供給で計測・解析が可能な小型装置の作成に成功した。また、反応液流路を最適化することにより、計測を止めることなく、明環境下、計測環境の乾燥を伴わずに簡単なピペット操作にて任意のタイミングで任意の反応液をマイクロアレイ上に供給できるシステムの構築に成功した。さらに、本システムを用いることにより、マイクロアレイ上の糖鎖および複合糖質（糖ペプチド）糖鎖の品質管理をラベル化レクチンにて実施可能であることを実証した。

（２）マイクロアレイ上の糖鎖・糖ペプチドの品質管理に必要な迅速高感度構造解析技術の開発

レクチンは生体内のような複雑系環境において糖鎖構造を解析するうえで有用な構造情報を与える有用なプローブ分子であるが、タンパク質の高次構造をその相互作用に利用しているため、その周辺環境に影響を受ける可能性がある。申請者はその糖鎖合成遺伝子の変異による機能異常が疾患に関与していることが報告されているO-マンノース型糖鎖を有する糖ペプチド類の糖鎖構造変化をレクチンにより追跡する研究を先行研究で実施しており、（１）の実験においてもこのO-マンノース型糖鎖を利用したところ、先行研究と同様の糖鎖構造―相互作用パターンを示した。しかし、この相互作用パターンのうち、特にシアリル化された糖鎖とレクチンの相互作用パターンでは試験した既知のシアル酸特異的結合レクチン（SSAおよびMAM）は結合せず、シアル酸とN-アセチルグルコサミンの双方を認識することで知られるコムギ由来レクチン（WGA）のみがシアリル化糖鎖結合性を示すことを再現することに成功した。この既知の相互作用パターンとの相違により査読者の理解が得られず、この研究の論文化が遅れていたが、この相互作用実験の再現に力を得て論文を再構成し投稿したところ、無事に採択された。代表者らは標準合成サンプルを用いて基礎データを取得しているため、その構造活性相関には自信を持っているが、この経験は蛍光強度の観測でその構造データを証明するという本課題の根幹が外部評価の際に疑われる可能性を示すものであり、これを実証できる他の分析手段と組み合わせる必要があった。しかし、マイクロアレイで必要なサンプル量は10-14～10-19　molという極めて微量であり、そのレベルで構造解析が可能な分析手段は質量分析に限られた。しかし、今回問題となったシアル酸を含有する糖鎖はイオン化の際にシアル酸の脱離を伴いやすいことから、これまで糖鎖の質量分析の世界ではシアル酸のカルボン酸を化学修飾しその脱離能を低減させてから計測することが常識となっていた。しかし、反応追跡法として使用する場合、化学修飾と精製工程を挟むことは本末転倒であり、その化学修飾を経ることなく構造解析（品質管理）が必要な方法論の開発が必要であった。そこで、我々のマイクロアレイ解析技術と同様にピペット操作のみで多数のサンプルや反応点の計測が可能なマトリックス支援レーザー脱離イオン化法（MALDI-TOFMS）に焦点を絞り、その際に使用するマトリックスと呼ばれる添加剤の改良を行った。近年、MALDI-TOFMSの新規マトリックスとして従来使用されている酸性マトリックスに有機塩基を添加することにより、様々なイオン性液体が発見され、特に糖鎖解析において数桁の感度向上を示すものも報告されていた。そこで、報告されている糖鎖解析用液体マトリックスを全て調査したが、遊離のシアル酸を分解することなく計測可能なものは見出すことができなかった。そこで、さらに金属添加材に着目し、種々検討した結果、シアル酸の脱離を伴うことなく、従来のマトリックスよ100倍以上の感度でシアリル化糖鎖をイオン化できるマトリックスの発見に成功した。

以上、当初目的とした糖鎖自動合成操作が実施可能なマイクロアレイ観測装置に加え、作成した糖鎖・複合糖質の多元的構造解析を可能とする質量分析技術の開発に成功した。これらの技術は今後の糖鎖・複合糖質マイクロアレイを含む糖鎖機能解析研究の基盤技術として基礎研究に加え医療などへの応用分野にも積極的に利用されることが期待される成果である。

事業内容についての問い合わせ先

所属機関名：　北海道大学　（ホッカイドウダイガク）

住　　　所：　〒001-0021

札幌市北区北21条西11丁目

担　当　者：　教授　　比能　洋（ヒノウヒロシ）

担当部署：　大学院先端生命科学研究院

E-mail：　hinou@sci.hokudai.ac.jp

ＵＲＬ：　http://altair.sci.hokudai.ac.jp/g4/