自動磁性細胞組裝生產球體SPHEROID的應用技術

使用 Fluent® 自動化工作站、D300 e數位分配器和 Spark® Cyto 多模式讀取器來簡化 3D 細胞培養的藥物反應評估。

原文自Tecan 應用文章

介紹

　　3D細胞培養系統已成為生物醫學研究中寶貴的工具，與傳統的二維（2D）細胞培養相比，它更貼近原生組織微環境的模擬。3D 球體（SPHEROID）結構 - 細胞的緊密聚合體 - 特別引起關注，因為它們能夠模擬體內細胞的行為，包括增殖、分化，以及對刺激的基因或代謝反應。隨著這些3D模型的應用增加，對確保篩選試驗的再現性、可擴展性和效率的需求也在增加。這需要與自動化液體處理兼容的方法，使用能夠使用微孔盤進行準確可重複的基於影像的評估。

　　磁性三維細胞培養（M3D）提供了一種解決3D細胞培養中一些當前挑戰的方法，可以快速且一致地生成球體（SPHEROID）。該方法涉及使用納米粒子將細胞磁化，納米粒子靜電吸附在細胞膜上，然後將它們放入放置在磁陣列上方的抗細胞板（cell-repellent microplates）上，以加速形成尺寸一致的球體（見圖1）。

　　本應用注解演示了如何使用Fluent自動化工作站自動化這種方法。為了展示所得球體在化合物篩選中的有效性，使用D300e數位分配器在含磁化球體的微孔盤上創建低體積濃度梯度。Fluent工作站、D300e分配器和M3D的組合顯著加速了工作流程，減少了時間和材料的消耗。此外，使用Spark Cyto多模式閱讀器在生長階段進行基於影像的質量控制 - 確保可靠的篩選結果 - 並通過進行基於發光的細胞活性評估來分析劑量-反應效應（見圖2）。

[細胞培養]

　　HeLa細胞（DSMZ，#ACC 57）根據生產商的方案在第12代解凍。細胞被種植在T75瓶中，每瓶種植50萬個細胞，並在Dulbecco's modified Eagle's medium（DMEM），高葡萄糖，增殖培養基（Merck，#D6429）中擴展，該培養基添加了10％的胎牛血清（FBS; Gibco，＃10270-106）。細胞在濕潤環境中保持（37°C，5％CO2），在使用之前進行一次分裂。

[細胞磁化和收集]

　　將Nanoshuttle™-PL（Greiner Bio-One，＃657852）用於細胞磁化，添加至T75瓶中，直至細胞達到70％的擁擠度。移除培養基，並將20毫升新鮮培養基與1.2毫升Nanoshuttle試劑混合，然後加入到培養瓶中。經過隔夜培養後，使用TrypLE™ Express Enzyme（Gibco，＃12605010）酶消化細胞並使用Vi-CELL™ XR細胞計數器（Beckman Coulter）計數。

[球體形成]

人工操作

　　為了在Fluent上實現自動化之前，對於M3D方法，細胞種植密度進行了手動優化。為了實現這一點，將HeLa細胞以不同濃度種植在平底96孔微板（Greiner Bio-One，＃655976）中的100μl體積中 - 每個孔中的細胞數為2,000，5,000，10,000和15,000 - 以確定合適的種植密度。在384孔微板（Greiner Bio-One，＃781976）中測試每個孔中的50，100，200，1,000，2,000和4,000個細胞以40μl體積進行測試。細胞種植後，將微板放在室溫下的4個磁驅動器上（Greiner Bio-One，＃655830和＃781830）中，持續1小時，然後放入標準培養箱中，以37°C，5％CO2和高濕度培養。

自動操作

將一個平底的384孔微板（Greiner Bio-One，＃781976）放在相應的磁驅動器上，使用RGA拆除蓋子。然後使用MCA一次性向所有孔中種植4,000個細胞，每個孔40μl體積。細胞種植後，更換蓋子，將微盤放在磁驅動器上室溫下持續1小時，然後轉移到Cytomat 2 C450-LiN，培養在37°C，5％CO2，相對濕度高於90％的環境中24小時，以促進球體的形成。

成像

人工優化細胞密度，使用Spark Cyto上的4倍物鏡進行明場成像，在96孔微盤中種植後24小時進行。通過使用GraphPad Prism計算面積來確定球體的大小（每個細胞濃度n = 22-24個球體）。此外，在使用Fluent自動種植後24小時，在384孔微板中使用10倍物鏡進行明場成像，以確保在添加藥物之前成功形成球體。

藥物處理

　　新形成的球體在自動種植後24小時進行化合物處理。將D300e分配器放置在標準層流生物安全櫃中，並將藥物庫存溶液（10 mM DMSO中）以不同濃度應用於T8+卡匣的測試板上。對多種藥物（全部由Selleckchem提供）進行了評估，包括：

• Gemcitabine (S1714)

• Doxorubicin (S1208)

• Topotecan (S1231)

• Panobinostat (S1030)

• Dexamethasone (S1322)

• Mitoxantrone (S2485)

• Idarubicin (S1228)

• Mitomycin (S8146)

• Vincristine (S1241).

每種化合物進行了10個不同濃度的重複測試，涵蓋了從0.4 μM到10 μM的對數分佈範圍。也創建了沒有任何藥物和純DMSO的40 nl（等同於最高藥物濃度的分配體積）的控制孔。

細胞存活評估

在藥物處理後的72小時內，使用CellTiter-Glo® 3D細胞存活試劑（Promega，＃G9681）評估了384孔微板中的球體存活率。將微板和試劑平衡至室溫30分鐘，然後每孔加入40 μl CellTiter-Glo 3D試劑，在將微板放在1000 rpm的軌道板搖盪器上5分鐘，以促進細胞裂解。然後將微板轉移到Spark Cyto進行25分鐘的測量前，以便訊號穩定。使用自動OD濾光片減弱高強度光，並以100 ms的積分時間測量發光信號。

分析

用於確定球體大小的面積計算（每種狀況n = 22-24個球體），以及分析和繪製藥物反應數據，都是使用GraphPad Prism進行的。對數據點擬合了4點非線性回歸曲線，並計算了IC50值。通過確定每種化合物的R2值來評估曲線的擬合度。使用公式計算了Z’ prime因子，

其中SD代表陽性和陰性對照的標準差。

結果

人工操作

　　在種植後24小時進行成像確認了單一、緊密和尺寸一致的HeLa球體在平底96孔微板中的形成，所有測試種植濃度都是如此（圖4）。每個條件下獲取了22到24個球體，所有球體都可以在Spark Cyto的4倍物鏡的單一視野中捕捉到。

　　在384孔微盤中，最均勻且緊密堆積的球體來自每孔最初2,000和4,000個細胞的濃度（未顯示數據）。因此，選擇了每孔4,000個細胞的種植濃度用於在384孔微板中進行自動種植。

自動操作

　　使用MCA，整個384孔微盤可以在不到一分鐘的時間內同時種植HeLa細胞。在藥物處理之前，使用Spark Cyto進行了明場成像，以確認球體的形成。

　　活性測試確定了對於大部分測試化合物（包括vincristine, staurosporine, and pano-binostat）對HeLa球體存活率的明顯影響（見圖7A）。相比之下，即使是濃度較高的gemcitabine, topotecan, 和 obatoclax也表現出明顯的耐受性，顯示出較高或無法確定的IC50值（見圖7B）。

　　所有相關化合物的R2值均高於0.9，表明線性回歸模型與數據匹配良好。預期地，未處理和僅處理溶劑（DMSO）的球體顯示出最高的細胞存活率。 Z’因子為0.77進一步表明這是一個強大的測試，具有良好的正負對照之間的區分度。

　　活性測試確定了對於大部分測試化合物（包括vincristine, staurosporine, and pano-binostat）對HeLa球體存活率的明顯影響（見圖7A）。相比之下，即使是濃度較高的gemcitabine, topotecan, 和 obatoclax也表現出明顯的耐受性，顯示出較高或無法確定的IC50值（見圖7B）。

　　所有相關化合物的R2值均高於0.9，表明線性回歸模型與數據匹配良好。預期地，未處理和僅處理溶劑（DMSO）的球體顯示出最高的細胞存活率。 Z’因子為0.77進一步表明這是一個強大的測試，具有良好的正負對照之間的區分度。

結論

　　本應用手冊介紹了一種M3D細胞培養的自動化工作流程，使用Fluent工作站在適合下游高通量篩選應用的平底微盤中生產均勻大小的球體。利用Spark Cyto進行基於成像的評估，實現了生長監測和活性評估在單一設備上進行，提高了數據獲取效率，並通過多重化增加了數據的意義性。384孔微盤的使用擴展了通量，使得可以同時分析更多樣本，同時減少了時間和材料的消耗。結合受控的球體形成與自動化液體處理和高質量成像，增強了使用3D細胞培養的藥物篩選工作流程的通量和可重複性，在藥物發現和生物醫學研究中具有應用價值。

REFERENCES.

1) Souza, G., Molina, J., Raphael, R. et al. Three-dimensional tissue culture based on magnetic cell levitation. Nature Nanotech 5, 291–296 (2010). https://doi.org/10.1038/nnano.2010.23

2) Timm, D., Chen, J., Sing, D. et al. A high-throughput three-dimensional cell migration assay for toxicity screening with mobile device-based macroscopic image analysis. Sci Rep 3, 3000 (2013). https://doi.org/10.1038/srep03000