打開單細胞蛋白質體學的大門

原文出處:Opening The Door To Single-cell Proteomics - Tecan Journal - Tecan

　　在生物樣本中量化獨特蛋白質傳統上需要數千、數萬甚至數百萬個細胞，無法辨識群體內的細胞異質性。為了解決這個問題，布里格漢楊(Brigham Young University)大學的研究人員一直在評估單細胞分配的潛力，以便對個別細胞進行蛋白質體分析。位於猶他州普羅沃市的布里格漢楊大學的Kelly實驗室專注於超靈敏的生物化學分析。單細胞和高解析度的空間蛋白質體學特別引人注目。化學和生物化學系教授萊恩·凱利解釋道：“細胞是生命的基本單元，我們希望更深入地了解生理學，尤其是病理生理學，以及癌症等疾病是如何起源和發展的。例如，固體腫瘤不僅僅是細胞的均勻集合，而是不同細胞類型的複雜排列。這些細胞的排列決定了癌症初始階段的腫瘤微環境，以及它是否會被免疫系統針對性地消除，或者受到保護以幫助它逃避身體的防禦。”

　　凱利實驗室的研究人員正在使用單細胞分配技術來進行個別細胞的蛋白質體分析。單細胞蛋白質體學（SCP）的出現使研究人員能夠以前所未有的細節來研究細胞過程，提供了無法通過大規模蛋白質測量或使用其他組學方法進行單細胞分析時獲得的信息。不幸的是，商業化的單細胞分離和蛋白質體學樣本制備平台成本高昂，需要技術專長來操作，並且常常受到其他系統限制的影響，因此限制了它們的可訪問性。萊恩繼續說道：“我們的專業領域是對個別細胞中的蛋白質進行分析。”

　　單細胞测序方法已經存在一段時間，並提供了許多獨特的見解。然而，直到最近，還沒有一種直接在這些細胞內部對蛋白質表達進行分析的方法，而不是基於信使RNA進行推斷。相反，我們進行的是大規模、深入的測量，這使得我們可以對每個樣本中數千種獨特的蛋白質進行定量分析，但無法分析單個細胞。為了克服這一障礙，我們現在已經在整個工作流程中開發了方法——樣品準備、分離和質譜分析——使我們能夠廣泛地對單個細胞中的蛋白質進行定量分析，同時提高了測量速度。現在我們有了解剖腫瘤的細胞，對每種不同的細胞類型中的蛋白質進行定量分析的工具，並有時還可以獲得空間信息，而不是將整個腫瘤放入攪拌器中，然後測量整個樣本中蛋白質表達的平均值。

　　實驗室的主要焦點之一是將其開發的方法讓其他研究人員更容易接觸，團隊開始建立了機器人納米液體分配平台，以撿取和傳遞極小體積的試劑至單個細胞，並製作了用於顯微鏡玻璃片的定制納米井。萊恩補充說：“傳統的蛋白質組學方法無法應用於單個細胞。單個細胞的體積約為一皮升，因此如果將一個單個細胞放入標準反應體積中（例如100微升），細胞內容將被稀釋100百萬倍；這就像把一顆葡萄擠入一個大游泳池中一樣。明顯，微型化是前進的方式。”

　　“我們從完整細胞開始，最終目標是得到可供分析的肽段。這需要細胞裂解、蛋白質提取，以及可能的破壞保留蛋白質原生結構的二硫鍵。還可能需要烷化步驟以防止二硫鍵重新形成。然後，蛋白質會暴露在蛋白酶（通常是胰蛋白酶）中，將其切割成較小的肽段，更容易進行測量。微型化使我們能夠將肽段稀釋和與反應容器的表面接觸減至最低，同時具有較高的蛋白質濃度，這使消化的動力學更加有利。幸運的是，無需進行樣品清理步驟，因為污染物水平不足以干擾下游過程，任何增益都將被蛋白質損失所抵消。”

　　迷你化工作流程，nanoPOTS（Nanodroplet Processing in One pot for Trace Samples），現在被其他SCP實驗室使用，同時積極開發無標記和多重標記方法。“雖然我們兩種方法都使用，但我們的團隊主要專注於無標記蛋白質組學，” Ryan 說道。“我們感興趣的是了解存在哪些蛋白質，而不是利用這項技術針對特定蛋白質。這種技術還是定量的；我們可以根據所測得的肽段質譜強度推斷蛋白質的豐度。我們也在探索多重標記方法，通過進行額外的反應來加入條形碼標籤。”

　　大約一年前，我們實驗室開始使用Uno單細胞分配器，以提升對於癌症和發育生物學等生物醫學研究領域的高級技術的可及性。這款自動化的臺上型設備能夠非常有效地將單個細胞分離到井中，然後為其準備蛋白質組學分析。這不僅使SCP對我們來說更加容易，也使得這項技術相對於其他商業可用解決方案的低成本，更廣泛地可供普通社群使用。

　　很明顯，在新技術被採用為例行操作之前，必須進行全面驗證，我們需要確定，當系統軟體報告單個細胞存在時，井中不含有多個細胞。因此，我們選擇通過質譜法驗證Uno系統的單細胞分配準確性，並成功展示了97％的準確度。此外，通過螢光測量驗證試劑分配的準確性，發現在200納升至2微升的範圍內都是準確且可重複的。我們現在常規使用Uno，因為它非常適合從懸浮液中分離細胞，以獲得對整個細胞群體的公正觀察，以及進行低體積試劑的分配。它非常簡單快速，我們知道可以信賴其準確性。分配也是無接觸的，所以我們不必擔心交叉污染。我們喜歡Uno，並認為它將對單細胞蛋白質組學領域產生相當大的影響，” Ryan總結道。

1. Sanchez-Avila, X. et al. Easy and Accessible Workflow for Label-Free Single-Cell Proteomics. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 2023, 34, 10, 2374-2380. https://doi.org/10.1021/jasms.3c00240