Research

　私が取り扱う主要な研究テーマは以下のものです。分類群としてはハラタケ綱菌類 (Agaricomycetes)を、機能群としては樹木の共生菌類である外生菌根菌 (ectomycorrhizal fungi)を主な対象としています。以下に、私が行ってきた研究を紹介します。

菌類の隠蔽種を識別する方法

　菌類の隠蔽種を識別するのにもっとも有効なのは遺伝子（DNA)解析です。厳密には、人工交配実験が生殖隔離を検証する上では最も直接的な手法ですが、容易に胞子培養を行える菌群が限られることや、新鮮な菌サンプルを要することから、手軽に行える手法とは言い難い面があります。一方、DNA解析は菌群を問わず適用可能な手法であり、死んだ生物組織（乾燥標本など）に対しても使用できるので、菌類で隠蔽種を探索するには最適な手法であると言えます。

　様々な遺伝子領域の中でも、一つの形態種の中にどの程度の隠蔽種が含まれているかを知る上で最も有用なのが、菌類のバーコード領域であるITS領域（リボソームRNAの遺伝子間領域）です。というのも、ITS領域では、様々な菌群で利用可能なPCRプライマーが開発されている上、種間変異が検出できる程度に進化速度が速いからです。大抵の場合、ITS領域のDNA塩基配列から構築した分子系統樹を見るだけで、一つの形態種の中にどの程度の隠蔽種が含まれているかを予測することができます。

　ただし、ITS領域の結果だけでは生殖隔離があるかどうかまでは判定することができないので、生殖隔離の検証には、同じ地域から採取した菌サンプルを対象に多数の遺伝子配列を解読して遺伝子流動を調べる必要があります。同所的に生育している菌群の間で、遺伝子流動に強い制限が見られるのであれば、これらの菌群の間には生殖隔離が働いている可能性が高いと判断することができます。また、多数の遺伝子の結合配列に基づいて構築した分子系統樹も、種の境界を判別する上で有用な情報となります（ITS領域の分子系統樹では解像度不足に陥ることも多いため）。

なぜ、菌類で隠蔽種の識別が重要?

　『形態が違わないのなら無理に種を分けなくてよいのでは?』という疑問もあるかもしれません。ですが、種は、人から見て違いが分かりにくいから分けなくてよいというものではありません。当事者である生物（この場合、菌類）が互いに別だと認めている（交配できない）ものを見つけ出すのが分類学という学問だと私は考えています。

　また、隠蔽種を識別することは、個々の菌種が本来もっている生態や性質の発見にもつながります。ここで、私が博士課程の際に行ってきたイグチ科のオニイグチ属菌（Strobilomyces）の例を挙げます。オニイグチ属菌では、私が博士課程で研究を始めた時点では、国内でオニイグチ、コオニイグチ、オニイグチモドキとトライグチ（修士課程のときに新産種記載）の4つの形態種がありました。これらに対して、DNA解析を行った結果、トライグチを除く3つの形態種はいずれも複数の異種が混同されている可能性が高いことが示されました（図1）。このうち、京大近くの吉田山でタイプ1（アミアシオニイグチ, S. hongoiとして新種記載）、タイプ3（オニイグチモドキ, S. confusus)とタイプ4（コオニイグチ, S. seminudus）が共存していることに着目し、これらの宿主樹種（菌根共生する樹種）の比較を行いました。その結果、タイプ1はブナ科、タイプ4はブナ科の中でもコナラ属のみ、そして、タイプ3はブナ科とマツ科の両方を宿主としていて特にアカマツとの共生頻度が高いことが示されました(図2）。従来、宿主の種類を選ぶ性質はオニイグチ属菌にはないとされてきましたが、本研究で隠蔽種の識別を行うことによって、近縁種間でも宿主樹種の構成に顕著な違いがあることが分かりました。このように、隠蔽種を識別することは、個々の菌種が本来もつ生態・性質を解明する上で大いに役立ちます。

隠蔽種研究とは何なのか？

　『形態がどのくらい類似していたら隠蔽種とみなすのか?』という質問は受けることがたまにあります。個人的には、この点は、本質からずれた論点と感じています。というのも、見分けにくいかどうかというのは単に個々人の主観や認識力の問題なので、少なくとも生物学的には意味があるとは思えない論点だからです（生物学ではなく、人の認知の研究領域から見ると、面白いのかもしれませんが）。

　この疑問に対する直接的な回答にはなりませんが、隠蔽種研究をする上で鍵となるのは、『種を分ける』という工程と、『個々の種を人が識別するための形質を見つける』という工程を明確に区別することです。遺伝子解析技術が発展する以前の古典的な分類学では、これらの2つは分けること自体が困難でした。しかし、遺伝子解析術が発展した現在では、『種を分ける』工程にはDNA情報を活用することができます。この工程に、情報量が少なく可塑性にも左右される形態形質をわざわざ持ち込む意義は薄く、むしろ主観やミスリードを招くリスクの方が高いと考えられます。このような概念に基づいて生まれたのが隠蔽種研究です。すなわち、隠蔽種研究とは、客観的な種分類を追究するため、『種を分ける』という工程から形態形質を使うことを放棄した分類手法なのです。そして、遺伝子解析技術に基づいて種を分けた後に、種を識別するのに有用な形態形質も含めて、個々の種の特徴を見出していくことになります。実際、形態で種を分けようとするとドツボにはまりそうな菌群でも、分類情報が分かった上で形態を見ると、驚くほど簡単に識別形質が見つかることもあります。

　『分類をする上で形態の違いも重要だろう！』という批判もあると思いますが、この点に関しては、生物群による違いが大きいと私は考えます。例えば、動物の場合では、見た目の形質は交配相手を選ぶ（同種を認識する）上でしばしば重要な情報となります。種子植物の場合でも、繁殖器官である花の色や形は、どういった動物が放花するかに強い影響を与えます。これらの生物の場合、情報量が少ないからと言って、安易に形態形質を見ないとしてしまうのは確かに危険です。一方、菌類などの微生物の場合はどうでしょうか？菌類には目がないので、人が見て分かる形の違いが交配可能性に影響しているとは考えにくいところです。したがって、菌類の場合、情報が乏しく、可塑性も強い形態形質にあえて重みづけをする正当性が見当たらないのです。このような背景から、私は、菌類では、中途半端に形態形質を使うよりも、遺伝子情報だけに基づいて種を分けた方が妥当ではないか（技術が発展する以前の伝統的な分類手法や、生物学的な背景が違う大型の動植物の手法に盲目的に追従するのは危険）と考えています。

背景

　私たちがいわゆる『きのこの仲間』と認識している菌類は単系統群ではないのですが、その多くは担子菌門ハラタケ綱（Agaricomycetes)という分類群に属しています。また、ハラタケ綱には、木材腐朽菌、落葉分解菌、植物寄生菌や外生菌根菌など、様々な機能群の菌類が存在しています。特に、温帯林や熱帯林の優占樹種の共生菌である外生菌根菌は、その多くがハラタケ綱に属しています。ハラタケ綱菌類には、他の菌群と同様、未報告種が非常に多く種多様性の実態はよく分かっていませんが、全世界で少なくとも数万種は存在するとされています。このように、ハラタケ綱菌類は地球上に広く繁栄し、多様化した生物と言えますが、どのようなきっかけできのこの仲間が現在のような高い種多様化をもつに至ったのかは、精度の高い解析が難しく、これまでの研究では十分に解明されていませんでした。

　一般的に、生物の種多様化を促進する要因は、① 新たな生育環境への進出を可能とする形質の進化 (Key innovation)、② 大量絶滅による空きニッチの拡大、③ 新たな生育環境の誕生（海底火山の噴火に伴う島の形成など）や、④ 新たな生育環境への移入、などが考えられます。中でも、分散能力が比較的高い菌類において特に重要となるのは、①と②と考えられます。②については、化石の残りにくい菌類では検証がどうしても難しいので、私の研究では①のKey innovationに着目しています。

宿主転換による外生菌根菌オニイグチ属の種多様化

　この研究は、外生菌根菌の種多様化 (Key innovation)を引き起こしたのは『共生相手となる樹種の転換』だったのではないかという仮説の検証を目的とした研究です。外生菌根菌では、種ごとに、共生できる樹木の種類が大よそ決まっているため、相性のよい樹木のいる場所でなければ生育できません。一方、外生菌根菌は、その進化の過程で、ごくまれに共生相手の樹種を換えること（宿主転換）があります。このような背景から、外生菌根菌は、狭い地域に分布する樹木から広い地域に分布する樹木へ宿主転換することで急速な分布拡大を果たし、その後に異所的種分化が促進される形で種多様化が進んだのではないかと考えました。

　この研究では、まず、外生菌根菌の一種であるオニイグチ類 (イグチ目イグチ科のオニイグチ属とAfroboletus属) を研究材料として、ハイスループットシーケンサ―を用いて多数遺伝子の塩基配列を同時に解読した後、それらの結合配列に基づいて分子系統樹を構築しました。次に、分子系統樹の樹形と、現存する種の共生樹種の情報から、オニイグチ類において祖先種がどのような樹木と共生していたかを推定しました。また、分子系統樹のどの部分に枝分かれが集中しているかによって、オニイグチ類の多様化速度が時間的にどのように変化してきたかについても推定を行いました。これらの結果から、オニイグチ類において、宿主転換と種多様化という2つの進化上のイベントの間に密接なつながりがあるのかどうかを調べました。

　その結果、オニイグチ類の共生相手の樹木は4種類に分けられ、オニイグチ類はその進化の過程で何度も宿主転換してきたことが分かりました(図3）。また、オニイグチ類では、過去に複数回、急速な多様化が起こっていて、共生相手となる樹木の種類が変わると多様化する速度が大きく変化することが示されました（図4）。とりわけ、北半球の温帯地域に広く分布するマツ科・ブナ科の樹木を共生相手にした後にオニイグチ類は顕著に多様化していたことが示されました（図4）。このような結果から、オニイグチ類は、宿主転換によって、分布可能な地域を拡大し、多様化してきた可能性が高いことが示されました。

　北半球の温帯性樹種に宿主転換し、多様化したというパターンは、様々な外生菌根菌で平行して起こった可能性があります。このような多様化が起こったことで、外生菌根菌は北半球の温帯地域で多様性のピークをもつようになったのではないかと私は考えています。

　この研究に残された課題は、オニイグチ属という一つの分類群に限定した結果であることと、詳細な宿主樹種の判定ができていないことです。前者については、他の外生菌根菌の分類群においても、検証を進める必要があると考えています。後者については、菌根のDNAバーコーディングを行って、宿主樹種の同定を詳細に行った上で研究を進める必要があると考えています。

外生菌根性の獲得に伴うイグチ科の種多様化

　この研究は、『特定の時期に外生菌根性を獲得したことが菌類の種多様化につながった』という仮説を検証した研究です。先行研究の結果から、外生菌根性の進化は必ずしも菌類の種多様化を促さないということが報告されていました。しかしながら、これだけで、『外生菌根性の進化は種多様化と無関係』と結論付けるのは早計ではないかと私は考えました。というのも、外生菌根性の獲得が種多様化をどの程度促すかは、外生菌根性の獲得するタイミングによって大きく異なると考えられるからです。例えば、進化的先住効果の側面から考えると、外生菌根性を早期に獲得した分類群ほど、外生菌根共生というニッチを先取りでき、種多様化しやすいと予想することができます（仮説1）。また、植物の進化史上の重要なイベントとして白亜紀後期に起こった被子植物の種多様化が挙げられます。これを考慮すると、白亜紀後期に、被子植物（ブナ目など）との外生菌根性を先んじて獲得したことが種多様化を促すKey innovationとなったという予想もできます（仮説2）。この研究では、イグチ目の分子系統学的な解析から、これら2つの仮説を検証することを目的としました。

　先の研究と同様に、イグチ目を研究材料として、ハイスループットシーケンサ―を用いて多数遺伝子の塩基配列を同時に解読した後、それらの結合配列に基づいて分子系統樹を構築しました。次に、分子系統樹の樹形と現存種の生活様式（外生菌根性か否か）に基づいて、イグチ目において外生菌根性がいつどこで進化したのかを推定しました。さらに、イグチ目の多様化速度が時間的にどのように変化してきたかについて推定を行いました。これらの結果から、イグチ目において、外生菌根性の進化と種多様化という2つの進化上のイベントの間に密接なつながりがあるのかどうかを調べました。

　その結果、イグチ目では、外生菌根性の進化は少なくとも4回独立に起こり、進化が起こった時期も異なることが示されました(図5）。また、イグチ目における多様化速度は、外生菌根性のイグチ科が派生したタイミングとほぼ同時期に急速に向上したことが示されました（図6）。4回起こった外生菌根性の進化のうち、イグチ科で起こったものは中間的な時期になるため、『外生菌根性の進化が早いほど種多様化を促しやすい』とする仮説1は否定されました。一方、この研究では、分岐年代推定は行っていないものの、先行研究の結果を考慮すると、外生菌根性のイグチ科の派生時期はおおよそ白亜紀後期になると考えられます。したがって、この研究の結果は、『外生菌根性の被子植物が出現した時期に外生菌根性を獲得した菌群で種多様化が起こる』とする仮説2を支持していると考えられます。

　この研究の結果から、『外生菌根性の進化は菌類の種多様化と無関係』とする従来の解釈は誤りで、特定の時期に外生菌根性を獲得することが菌類の種多様化につながった可能性が示されました。また、この研究を通して、『白亜紀後期に被子植物と外生菌根性を獲得したことが菌類の大規模な種多様化につながった』という仮説を提示しました。

　この研究の課題は、分岐年代推定を行っていないことと、白亜紀後期に外生菌根性を獲得したと考えられる菌群がイグチ科のみしかなかったことです。この課題については、次の研究において検証を進めました。

白亜紀後期の外生菌根性の獲得に伴うハラタケ綱菌類の種多様化

　この研究は、『ハラタケ綱菌類では、白亜紀後期に被子植物と外生菌根性を獲得したことが大規模な種多様化につながった』という仮説を検証することを目的とした研究です。先のイグチ目の研究では、白亜紀後期に派生したと考えられる外生菌根菌がイグチ科のみであったことから、イグチ目以外の分類群でも同じような種多様化のパターンが見られるかについて検証を進めました。

　ハラタケ綱菌類の多様化速度は、2種類の手法で推定しました。1つは先の2つの研究と同様に分子系統樹の枝の密集度合に応じて推定する方法です。もう1つの手法は、分類群ごとの起源した年代と現存する種数から推定する方法です。この手法は、急速な多様化を果たした分類群は、起源が新しい割に現存種数が多くなることを利用した手法です。分子系統樹を構築は、ハラタケ綱菌類から解読した89個の遺伝子配列を利用して行いました。この際、菌類の化石情報を校正情報として用いることで、年代情報を分子系統樹に加えました。ハラタケ綱に属する全分類群（目・科・属）の現存種数は、国際塩基配列データベースに登録されたハラタケ綱の配列情報を利用して推定しました。その後、上述した2つの方法を用いて、ハラタケ綱菌類の多様化速度を調べました。

　研究の結果、ハラタケ綱が急速な種多様化を果たしたきっかけは、白亜紀後期（9000万年前から7000万年前ごろ）に外生菌根性を獲得したことにあったことが分かってきました。ハラタケ綱で菌根共生の進化は、約2億5千年前から現在にかけて、様々な分類群で独立に何回も起こりました（図7）。その中でも、白亜紀後期に5つの分類群（フウセンタケ属・アセタケ属・イグチ科・ベニタケ科・イボタケ科）で独立に起こった外生菌根性の進化は、いずれも急速な種多様化を伴っていたことが示されました（図8-9）。この結果は、ハラタケ綱の種多様化には被子植物の存在が重要であったことを支持する結果と考えられます。というのも、白亜紀後期は外生菌根性の被子植物（ブナ目）が起源し、急速な種多様化を果たしたとされる時期でもあるからです。つまり、この時期にハラタケ綱と被子植物との間で密接な関わりがあったと考えられます。この研究結果から、ハラタケ綱は、白亜紀後期に被子植物と出会って菌根共生を始めたことがイノベーションとなり、新たな広大な土地へと進出し、急速な多様化を果たしたという可能性が見えてきました。

 一方、本研究の最大の課題として挙げられるのは、分子系統樹に組み込んだ菌種の数が少なすぎることです。この影響については、先行研究で得られた大規模な分子系統樹を使った解析も行い、同様の結果が得られることも確認はしています。慎重な検討を行ってはいるものの、更なる検証の余地は残されていると考えています。

背景―大型菌類の分布域と分散能力―

　大型菌類では、一部の例外を除き、ほとんどの菌種でどの程度の分散能力をもち、どの程度広域に分布するのかはよく分かっていません。その原因の一つは、菌類に隠蔽種が多いため、形態の類似した異種を混同してしまいやすく、個々の菌種の分布範囲を正確に評価しにくい（しばしば過大評価しやすい）という問題です。例えば、日本に生育する大型菌類の多くに欧州で記載された菌の種名が当てられていますが、実際には別種であることが後になって判明するケースが多いです。もう一つの理由は、菌類は菌糸といった肉眼では観察しにくい形状で生育していることが多いため、発見自体が難しいことです。サルノコシカケ類などの例外を除けば、ほとんどの大型菌類では子実体が観察できる期間は1年でせいぜい2週間程度なので、そこに生育していても発見できないことは往々にしてあります。このような事情から、分かりやすい子実体を形成する大型菌類であっても、その多くで分布パターンの実態はよく分かっていません。

　一方、菌類のバーコード配列であるITS領域の塩基配列は、NCBI、UNITEやGlobalFungiなどの塩基配列データベースに数多く登録されています。したがって、これらのデータベース配列を活用すれば、菌類の分布情報を知ることができると私は考えました。

以下、準備中（投稿中の論文の内容も含まれるため）