Nagasaki University
Graduate School of Biomedical Sciences
Department of Medical Virology
長崎大学大学院 医歯薬学総合研究科 ウイルス学分野
長崎大学大学院 医歯薬学総合研究科 ウイルス学分野
We pioneer innovative molecular technologies that make a difference in viral diagnostics.
新しい核酸検出技術とウイルス核酸検査の開発
HiBiT-PCR is developed by tailing PCR primers with sequences required for cell-free synthesis of HiBiT peptide which complements NanoLuc luciferase with LgBiT and generates strong luminescence in the presence of a NanoLuc substrate. HiBiT is intended to analyze proteins, but we make it available for nucleic acid detection. HiBiT-PCR achieved highly sensitive luminescence-based detection of M. tuberculosis genomic DNA.
発光による核酸検出は技術的に困難ですが、潜在的有用性があります。HiBiT-PCRは、PCRプライマーにHiBiTを発現させる配列を付加することにより、PCR産物からHiBiTを転写翻訳し、NanoLucルシフェラーゼによる発光でPCR産物を検出する技術です。HiBiTはわずか11アミノ酸のペプチドで、LgBiTと結合することにより、完全なNanoLucルシフェラーゼになります。HiBiT-PCRはqPCRよりも高感度です。
LAMP (Loop-mediated isothermal amplification)-TRAC (TRanscription And CRISPR-Cas12) is developed using a noncanonical Cas12a activation for detection of PAM-less target DNA sequences. LAMP primers are designed to transcribe crRNA directly from LAMP products. Following LAMP, transcribed crRNA activates Cas12a together with a dsDNA activator designed for crRNA and leads to trans-cleavage of ssDNA reporters. LAMP-TRAC achieved detection of as low as 4 copies/µL of M. tuberculosis genomic DNA.
CRISPR-Cas12aに基づく核酸検出は一般的に標的増幅産物にcrRNAとCas12aを結合させて、活性化したCas12aによって蛍光標識ssDNAを分解して蛍光を検出します。これに対して、LAMP-TRACはLAMP産物からcrRNAを転写して、それにdsDNA activatorとCas12aを結合させることによってCas12aを活性化します。LAMP-TRACは標的配列がPAM配列を含む必要はありません。合成crRNAも不要です。LAMP-TRACは結核菌のゲノムDNA 4 copies/µLを1時間以内に検出することができます。LAMP-TRACはqPCRよりも高感度かつ迅速です。
PCR-TRAC (TRanscription And CRISPR-Cas12) is developed using a noncanonical Cas12a activation for detection of PAM-less target DNA sequences. PCR primers are designed to transcribe crRNA directly from PCR products. Following PCR, transcribed crRNA activates Cas12a together with a dsDNA activator designed for crRNA and leads to trans-cleavage of ssDNA reporters. PCR-TRAC is sensitive enough to detect as low as 40 copies/µL of M. tuberculosis genomic DNA.
CRISPR-Cas12aに基づく核酸検出は一般的に標的増幅産物にcrRNAとCas12aを結合させて、活性化したCas12aによって蛍光標識ssDNAを分解して蛍光を検出します。これに対して、PCR-TRACはPCR産物からcrRNAを転写して、それにdsDNA activatorとCas12aを結合させることによってCas12aを活性化します。PCR-TRACはPAM配列と無関係に標的配列を選ぶことができます。合成crRNAも不要です。PCR-TRACによって結核菌DNAを検出するアッセイを開発しました。
We developed an advanced single-cell PCR technique to measure leukocytes containing DNA sequences of interest. Following separation of leukocytes from whole blood, cells are encapsulated in droplets. Target sequences are then amplified without cell lysis by in situ PCR. Fluorescence is generated from probes intracellularly and accumulates in droplets. Leukocytes containing target DNA can be measured at the single-cell level by counting positive droplets, because every droplet contains one or no cell. We successfully measured neutrophils containing S. aureus DNA and demonstrated its advantages over blood cultute for diagnosis of bacteremia.
Droplet Digital Cell PCR (ddcPCR) は細胞単位でPCRをする画期的方法です。ddcPCRによって目的のDNA配列の有無を細胞単位で定量することができます。通常、PCRの前には細胞の溶解と核酸の抽出をしますが、ddcPCRは細胞をまるごとPCR反応液に懸濁してドロップレットに封入します。In situ PCRによって細胞内で標的DNAを増幅してプローブによって蛍光を産生し、ドロップレット単位で蛍光の有無をデジタルに判定します。ドロップレット内に細胞が一つのみ存在する条件で、シングルセル分析が可能になります。細菌DNAを標的にして、血液中の貪食細胞(細菌を貪食した好中球)をddcPCRによって測定することにより、血流感染症の新しい診断法を開発しました。
We created CRISPR Gel that allowed highly sensitive detection of nucleic acids in a single-tube one-step format without the need of thermal cycler. We successfully applied CRISPR Gel to detect HIV RNA extracted from patient's plasma.
CRISPR-Cas12は一本鎖DNAを配列非依存的に分解する能力があるため、その特徴を利用して近年核酸検査に積極的に応用されています。特に等温核酸増幅法であるRecombinase polymerase amplification (RPA)と組み合わせることで、サーマルサイクラーを使わずに高感度な核酸検査を開発することができます。しかし、RPAとCRISPR-Cas12はバッファー条件が異なるため、同一チューブで反応を起こすことが困難です。CRISPR-Cas12反応液をアガロースでゲル化したCRIPSR GelはRPAとCRISPR反応を同一チューブ内で融合することを可能にし、シングルチューブで等温かつ短時間に標的核酸を高感度に検出することができます。例えば、CRISPR GelによってHIV RNAを39°Cで1時間以内に高感度に検出することができます。
We innovated PCR Gel allowing highly sensitive detection of nucleic acids in a single-tube one-step format. We successfully detected HIV RNA extracted from patient's plasma using PCR Gel and demonstrated that PCR Gel is more sensitive and faster than one-step RT-PCR.
PCR反応液をアガロースでゲル化したPCR Gelの上に等温核酸増幅法であるRecombinase polymerase amplification (RPA)反応液を加えることで、シングルチューブで高感度に標的核酸を検出することができます。PCR反応前にRPAによって前増幅をするため、PCRでは検出が困難な微量な標的核酸を検出できます。例えば、HIV RNAをRT-PCRより早く高感度に検出することができます。
We developed a streamlined methodology to implement clone-specific quantification of tumor cells that were infected with HTLV-1 and caused adult T cell leukemia in a clinical setting. Clone-specific digital PCR (CS-dPCR) allows clone-based diagnostics and treatment for adult T cell leukemia in a clinical setting.
腫瘍は必ずしも単一の腫瘍性クローンから構成されるのではなく、複数の腫瘍性クローンから構成され、それぞれのクローンは抗がん剤に対する反応などが異なることが知られています。Clone-specific digital PCR (CS-dPCR)は腫瘍化したHTLV-1感染細胞をクローン毎に定量する技術です。まず、ヒトゲノムのプロウイルス組み込み部位を選択的にPCRで増幅し、アガロースゲル電気泳動で腫瘍化した感染細胞をバンドとして検出します(特許7672671)。バンドが検出された場合、Amplicon deep sequencingによってそれぞれのクローンのウイルス組み込み配列を決定します。クローン特異的配列を基にデザインしたプライマーとプローブを用いて、CS-dPCRによって腫瘍性クローンを定量的に追跡することができます。このワークフローは成人T細胞白血病の臨床検査として有用です。
We developed a novel flow cytometry assay that can detect single-copy DNA targets in human leukocytes freshly separated from blood. The assay allowed us to analyze CD4+ lymphocytes containing HTLV-1 viral DNA by flow cytometry.
フローサイトメトリーは強力な技術ですが、標識しているのは抗原であって核酸ではありません。DNA Flow Cytometryは細胞内の特定のDNA配列を細胞内でPCRによって増幅かつ蛍光標識し、フローサイトメトリーで目的のDNA配列を含む細胞を分析する革新的技術です。この技術は標的DNAが細胞内に1コピーであってもその細胞を検出する感度があります。ヒトT細胞白血病ウイルス1型(HTLV-1)はヒトのCD4陽性細胞に感染しますが、ウイルス蛋白は通常発現しないため、ウイルス抗原を標識してフローサイトメトリーでHTLV-1感染細胞を分析することはできません。さらに、ウイルスDNAは細胞内に1コピーしかないため、FISHでもHTLV-1感染細胞の検出は困難です。DNA Flow Cytometryはこれらの技術的限界を打破し、HTLV-1感染細胞のフローサイトメトリーアッセイを実現しました。
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