생체는 정상적인 대사과정에서도 superoxide radical (O2-•), Hydroxy radical (OH•), 그리고 hydrogen peroxide(H2O2)를 생성하며, 비정상적인 대사이상 상태에서는 이들의 생성은 더욱 증가하게 된다. 이러한 활성 산소 종 (reactive oxygen species, ROS) 및 자유 라디칼 (free radical)들은 산화적인 스트레스를 주어 세포손상을 초래한다 (1). 

자유 라디칼이란 하나 이상의 짝을 이루지 않는 전자의 불안정한 분자로서 정상적인 세포의 대사에서 생긴 대사물로 이러한 radical의 주요 공급원은 산소 분자이며, 또한, 외인성으로 생체 이물질로부터 도 radical이 생성될 수 있는 것으로 알려져 있다 (2). 또한 자유라디칼은 생체 내에서 단백질의 -SH기나 DNA와 반응하여 생체 분자의 구조적인 변화를 야기시키고 (3), 이로 인해 효소활성의 저하와 단백질 손상 뿐 아니라 세포막의 불포화 지방산의 자동산화 연쇄반응을 통하여 세포막 지질성분의 과산화를 유발하여 노화, 뇌혈관 질환, 암, 심혈관계 질환 등과 같은 만성 질환들의 발생을 초래하기도 한다 (3)(Fig1).

 한편, ROS는 생체 내 유용한 생물학적 기질로서 작용하는데 세포 신호 분자로 작용할 뿐 아니라 박테리아, 바이러스, 곰팡이와 같은 항원에 대한 방어 역할을 수행한다(4). 이러한 작용을 수행하기 위해 ROS의 적절한 농도 유지가 요구되는데, ROS가 과다하게 생성되었거나 생체 항산화 방어 시스템 (antioxidant defense system)이 감소했을 때 염증 (inflammation), 신경 퇴화 (neurodegeneration)를 포함한 다른 여러 병변과정이 진행되어 산화적 조직 손상을 야기한다 (6). 

 인체의 항산화 방어란 대사과정이나 그 밖의 과정에 의해 생성된 free radical과 활성 산소종으로부터 산화적 손상을 방지하기 위한 생체의 방어 기전으로서 정의되며 (5), 항산화 효소에 의한 방어체계와 항산화제에 의한 방어체계로 나눌 수 있다.  

 항산화 효소에 의한 방어체계는 유해한 라디칼들의 작용에 대하여 효율적으로 조절할 수 있는 superoxide dismuatse (SOD), glutathione perosidase (GSH-Px), catalase, glutathione-S-transferase (GST) 등의 효소들이 작용하여 산화적 스트레스로부터 인체를 보호한다(3, 7) (Fig. 2). 한편, 항산화제에 의한 방어 체계는 비타민 C (ascorbic acid), 토코페롤 등과 같이 음식물 섭취로 생성되는 항산화 물질과 세포내 성분인 글루타치온 (glutathione), lipoic acid 등에 의해 수행된다.   

사염화탄소 (carbon tetrachloride, CCl4)는 냉매 (refregerants), 휘발유 첨가제 (petrol additives), 금속 탈지제 (metal degreasing), 그리고 반도체 생산에서 널리 사용되는 용매이다.  간 손상을 일으키는 대표적인 유도물질의 하나인 CCl4는 생체 내 활면소포의 nicotinamide adenine phosphate cytochrome P-450 monooxygenase에 의해 전자전달사슬에서 대사과정을 통하여 OOCCl3로 바뀌로, 이 radical이 간세포에 손상을 유도한다. 

OOCCl3은 소포체 막의 인지질인 polyenoic fatty acid의 methyl carbon을 공격하여 지질과산화를 야기하게 되고(6), 이 때 지질과산화물의 분해산물들 (malondialdehyde, 4-hydroxy-2-pentenal, 2,4-hexadienal, 4-hydroxy-2-nonenal)이 소포체의 구조적 붕괴, 소포체 내 효소의 활성 저하, 단백질 합성 저해 등을 일으켜 지방간 변성을 유발하게 되어, 최종적으로 간세포 괴사로 이어지는 독성 기전을 가지고 있다(7).  

지질 과산화 (lipid peroxidation, LPO)는 CCl4로 유도된 조직의 손상에 따른 주요한 현상으로 자유 라디칼에 의한 세포막의 손상에 대한 결과로서 지질 과산화뿐 아니라 CCl4 처리 시 간 손상에 따른 GOT (glutamic oxaloacetic transaminase), GPT (glutamic pyruvic transaminase), ALP 활성 (alkaline phosphatase activity)이 증가된다고 보고되어있다 (8).  

유해활성 산소와 free radical이 각종 질환 및 노화의 원인 중에 하나로 밝혀지면서 파이토 케미칼 (phytochemical)과 같은 식품 유래 성분의 유효성분들의 지질과산화 및 항산화 효소계 활성에 미치는 연구가 활발히 진행되고 있으며, 최근에는 비식품 성분인 금속 나노 성분의 항산화 활성에 관한 연구, 또한 이를 활용한 새로운 기능성 소재의 개발이 관심을 끌고 있다.    

금속나노 입자 (metal nanoparticles)는 수소첨가반응, 산화 반응과 같은 다양한 반응에서 촉매제로서 기능을 할 수 있다. 최근, 백금 나노 입자 (platinum nanoparticles)는 in vitro에서 활성 산소종 (reactive oxygen species, ROS)을 소거할 수 있는 항산화 활성이 보고되어 있다. 즉, 나노 사이즈의 금속 입자는 라디칼 소거에 효과적이며, 특히 금 나노 입자 (gold nanoparticles)는 DPPH 라디칼의 환원에 높은 가수분해 활성을 가진다고 보고되어 있다 (9). 

백금 나노 입자 또한 O2-•, H2O2와 같은 ROS의 소거에 효과적이며 따라서 백금 나노 입자가 항산화 효소인 SOD/catalase를 대신하는 항산화제로 작용할 수 있음이 보고된바 있다 (13). 또한 Toshihiro et al에 따르면 콜로이드 형태의 백금 입자 (colloidal platinum manoparticles)에 의한 DPPH, DCIP (2,6-dichlorophenol indophenol) 라디칼의 환원은 백금 나노 입자의 전자가 라디칼로 전달되어 백금 나노 입자가 라디칼 소거 활성을 나타낸다고 보고하였다 (10).   

비록, 백금 나노 입자가 free radical과 ROS를 소거하는데 유용하지만, 백금 나노 콜로이드는 백금 입자의 성질을 고르게 가지고 있을 뿐 아니라 입자가 고르게 분포되어있는 콜로이드의 형태이기 때문에 백금나노 입자를 함유한 백금 나노 콜로이드가 항산화 작용에 더 유용할지 모른다. 그러나, 백금 나노 입자/백금 나노 콜로이드가 in vivo에서도 항산화 활성을 나타낼 수 있는지에 대해 서는 알려져 있지 않다.     

본 연구에서는 백금 나노 입자 크기를 안정적으로 유지할 수 있는 신기술을 도입하여 만든 백금 나노 콜로이드 (platinum nanocolloid, 3~10 nm)을 사용하여 이 백금 나노 콜로이드의 항산화 기능을 in vitro 및 in vivo에서 조사하였다. 즉, 백금 나노콜로이드에 의한 in vitro에서의 항산화 활성, 라디칼 소거능, 간 세포 배양 모델계 (ex vivo)에서 산화적 스트레스에 대한 방어 효과, 그리고 CCl4을 투여한 동물 모델계 (in vivo)에서 간 손상 억제 효과를 조사하였다.      

1) in vitro 계 - 백금 나노 콜로이드의 free radical 소거능    

(1) H2O2 소거능 측정: H2O2 소거능은 분광 광도계 (spectrophotometer)를 사용한 방법으로 수행하였다(13). 요약하면, 석영 cuvette에 20 mM H2O2 2880 μl와 백금 나노 콜로이드 120 μl를 넣어 반응을 개시하였다. 실온에서 5분 후 잔여 H2O2의 농도는 분광 광도계를 이용하여 240 nm에서 측정되었다. 증류수 2880 μl에 희석된 120 μl 각 샘플의 흡광도는 블랭크로 사용하였다. 

(2) DPPH 라디칼 소거능 측정: DPPH 라디칼 소거능은 분광 광도계를 사용한 방법으로 수행하였다. 20 μl 백금 나노콜로이드와 메탄올에 0.1 mM로 희석된 DPPH용액 2 ml을 섞은 후 즉시 (0 min), 그리고 30분 (30 min) 뒤 분광 광도계를 이용하여 517 nm에서 측정하였다. 백금 나노콜로이드의 각 농도에서 DPPH 라디칼에 대한 억제 비율은 아래의 공식을 사용하여 계산하였다 (11).  

억제율 (%) = (Abst=0 min – Abst=30 min)/Abst=0 min X 100    

트롤록스 (0.5, 1 mM)는 산화 억제 효과를 대표하는 기준으로서 트롤록스 당량 항산화 활성 (Trolox equivalent antioxidant activity, TEAC)으로 나타내었다. 트롤록스 용액은 TEAC로 정의되며 이것은 각 농도의 백금 나노 콜로이드의 자유 라디칼 소거능을 가리킨다 (12).         

(3) SNP 용액 내 NO 소거능 측정: 백금 나노 콜로이드의 NO 소거능은 Green, L.C. et의 방법을 수정하여 수행하였다 (13). SNP (sodium nitroprusside)용액 1 mM은 인산 완충 용액 (phosphate buffer, pH7.4)에 희석시켰고 실험튜브에 즉시 첨가되어 백금 나노 콜로이드와 섞은 후, 실온에서 6시간 방치하였다. NO의 측정을 위해 5 % phosphoric acid에 1 % suplhanilamide, 0.1% naphtylethylenediamine을 함유한 그리스 시약을 각 샘플 양인 1ml을 동량으로 사용하였다. 이 혼합핵은 실온에서 20분간 방치되었고 546 nm 흡광도에서 측정되었다. NO 농도는 Sodium nitrite를 스탠다드로 사용한 기준 곡선에 의해 결정되었다.      

(3) SNP 용액 내 NO 소거능 측정: 백금 나노 콜로이드의 NO 소거능은 Green, L.C. et의 방법을 수정하여 수행하였다 (13). SNP (sodium nitroprusside)용액 1 mM은 인산 완충 용액 (phosphate buffer, pH7.4)에 희석시켰고 실험튜브에 즉시 첨가되어 백금 나노 콜로이드와 섞은 후, 실온에서 6시간 방치하였다. NO의 측정을 위해 5 % phosphoric acid에 1 % suplhanilamide, 0.1% naphtylethylenediamine을 함유한 그리스 시약을 각 샘플 양인 1ml을 동량으로 사용하였다. 이 혼합핵은 실온에서 20분간 방치되었고 546 nm 흡광도에서 측정되었다. NO 농도는 Sodium nitrite를 스탠다드로 사용한 기준 곡선에 의해 결정되었다.      

(4) •OH 소거능 측정: Deoxyribose 방법 (14)은 하이드록시 라디칼의 일정한 반응 비율을 결정하기 위한 간단한 방법이다. 백금 나노 콜로이드에 0.2 M sodium phosphate buffer (pH 7.0), 10 mM FeSO4-EDTA, 10 mM H2O2, 10 mM 2-deoxyribose와 물을 함유한 반응 용액을 섞고 이 반응은 H2O2에 의해 개시되었다. 37 ℃에서 4시간 방치 후 이 반응은 0.05 N NaOH에 1.0 % 2 thiobarbirutic acid와 2.8 % trichloroacetic acid 넣은 용액을 첨가하여 10분간 끓인 후 찬물로 급냉 시킨 후 520 nm 흡광도에서 측정되었다. •OH 소거능은 •OH에 의한 2-deoxyribose 산화의 억제 비율로서 평가되었다.     

2) ex vivo 계 – 산화적 스트레스로 유도된 세포손상 모델계     

(1) 세포배양: 인간 간세포인 HepG2는 한국세포주은행 (KCLB, Seoul, Korea)에서 구입하였고, 10% bovine serum과 10ml/L penicillin-streptomycin (Gibco BRL, NY, USA), 2 mg/l gentamicin (Gibco BRL, NY, USA)이 포함된 Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (Gibco BRL, NY, USA)으로 37 ℃, 5% CO2 배양기에서 배양하였다.      

(2) H2O2로 유도된 간 세포 독성 측정: H2O2로 유도된 HepG2 세포 손상의 정도를 LDH (lactate dehydrogenase) 세포독성 테스트 kit (Wako, Osaka, Japan)를 사용하여 측정하였다. LDH는 NAD의 존재 하에 lactate에서 pyruvate로의 전환을 촉진시키는데 이 반응에서 lactate는 pyruvate로 산화되며 동량의 NAD는 NADH로 환원된다. 형성된 NADH는 diaphorase의 존재 하에 purple-blue diformazan을 형성하는 nitrotetrazolium으로 환원시키며 이것은 560~570 nm 흡광도로 측정할 수 있다. 요약하면, 96-well plate에 HepG2 cell (40,000 cells/well)을 깔아 17 시간 배양하고 PBS로 2번 세척하였다. 그 후 100 μM H2O2를 다양한 농도의 백금 나노 콜로이드와 함께 15분 동안 처리하여 1000 rpm에 3분 원심분리하였다. 50μl의 배양액을 떠내어 동일한 양의 coloring solution을 분주하여 45분 동안 incubation 후 100 μl reaction terminator solution을 처리하여 570 nm 흡광도에서 측정하였다. 세포 손상 비율 (%)은 다음 공식에 의해 계산되었다. 

(3) H2O2로 유도된 세포 지질 과산화정도 측정: H2O2로 유도된 지질 과산화 정도를 측정하기 위해 LPO assay kit (Calbiochem, San Diego, CA)를 사용하였다. 요약하면 100 mm dish에 HepG2 cell가 90 %w정도 차면 100 μM H2O2를 다양한 농도의 백금 나노 콜로이드와 함께 24시간 처리하였다. PBS로 2번 세척 후 cell scraper를 이용하여 sampling하였고 1500 rpm에 5분 원심분리하여 윗층을 샘플로 사용하였다. 동일한 양의deoxygenated 메탄올로 포화된 Extract R을 첨가하여 vortexing 후 2배 볼륨의 deoxygenated 클로로포름을 첨가하여 1500 g에 5분간 원심분리하였다. 아래층의 클로로포름 layer를 채집하여 지질 과산화 측정을 위해 사용하였다.  

3) in vivo 계 – CCl4로 유도된 간 독성에 대한 백금 나노콜로이드의 보호 효과    

(1) 실험동물 사육 조건: 8주령의 male C57BL/6 mice (n=4)은 오리엔트 (pusan, Korea)에서 구입하였고, 모든 mice는 SPF (specific pathogen-free)상태의 사육실에서 사육되었다. 실험 동물은 22도, 55%의 습도를 유지하는 방에 12시간 주기로 light/dark cycle을 조절하였다. 식이는 irradicated pellet food를 공급하였고, 대조군으로는 멸균된 물을 공급하였고 실험군으로는 백금 나노 콜로이드를 1주일간 공급하였다. 옥수수 기름으로 희석된 20 % CCl4를 0.5 ml Kg/Bw으로 일주일에 2회 경구 주입하여 CCl4공급에 의한 생존율을 관찰하였다.    

(2) GOT, GPT, γ-GTP, ALP-activity 측정: 일주일간 대조군으로 멸균된 물을 공급하였고 실험군으로 백금 나노 콜로이드를 공급하였다. 옥수수기름으로 용해된 CCl4를 50 μl/Kg Bw으로 복강 주사 24시간 후 sacrifice하여 plasma에서 생화학적 지표를 GOT, GPT, γ-GTP, ALP-activity kit (아산제약)를 이용하여측정하였다.     

(3) 간 조직 중 지질의 과산화정도 측정: 과산화 지질 반응은 여러 가지 독성 화합물과 약물에 의한 병태 생리학적 현상이나 조직의 손상정도를 나타내는 가장 중요한 기전으로 인정되고 있으며, 조직의 손상, 발암, 염증, 성인병 및 노화 등과 같은 여러가지 유해 작용에 관련된다. 일주일간 대조군으로 멸균된 물을 공급하였고 실험군으로 백금 나노 콜로이드를 공급하였다. 옥수수기름으로 용해된 CCl4를 50 μl/Kg Bw으로 복강 주사 24시간 후 sacrifice하여 간에서 지질 과산화 정도를 지질 과산화산물인 MDA를 통해 측정하였다. 요약하자면, 간 시료의 4배인 1.15 % KCl 용액으로 균질화 시킨 후 1200 rpm에 10분 원심분리하여 상층액을 분리하여 15000 g에서 30분 원심분리 후 이것의 상층액을 샘플로 사용하였다. 유리 튜브에 8.1 % SDS (sodium Dodecyl sulfate), 1.15 % KCl, 20 % acetic acid, 0.8 % thiobarbituric acid, standard working solution (1.1.3.3-tetramethoxy propane, TMP)를 처리하여 1시간 동안 끓인 후 차갑게 식힌다. 여기에 물과 N-butanol-pyridine solution을 처리하여 3000 rpm에 15분 원심분리하여 상층액을 532 nm 흡광도에서 측정하였다. 

(4) 간 조직의 조직학적 검토: 일주일간 대조군으로 멸균된 물을 공급하였고 실험군으로 백금 나노 콜로이드를 공급하였다. 옥수수기름으로 용해된 CCl4를 50 μl/Kg Bw으로 복강 주사 24시간 후 sacrifice하여 간을 포르말린 고정시켜 H&E staining하여 현미경을 통해 관찰하였다.       

(5) 간조직 중 염증성 마커 발현: 염증성 마커인 COX2, iNOS 유전자 발현정도는 RT-PCR 로 측정하였다.     

(6) 염증성 사이토카인 TNFa 측정: LPS로 자극된 대식세포가 분비하는 염증성 사이토카인 TNFa 분비는 ELISA로 측정하였다.     

1) In vitro 에서 백금 나노 콜로이드의 항산화 효과: free radical, ROS 소거능   

Hydrogen peroxide (H2O2) 소거에 미치는 영향: 백금 나노 콜로이드가 ROS의 일종인 H2O2를 소거할 수 있는지를 조사하였다. 백금 나노 콜로이드 4~200 ppm처리했을 때 H2O2를 각각 7.2, 13.7, 31.4, 52, 84.1, 94.4, 100%까지 유의적으로 감소시켰으며 백금 나노 콜로이드의 농도가 증가할수록 H2O2 소거능의 효과가 높게 나타났다 (Fig4).    

Hydroxyl radial (•OH) 소거에 미치는 영향: 백금 나노 콜로이드가 free radical인 •OH를 소거할 수 있는지를 조사하였다. 백금 나노 콜로이드 6.3~200 ppm 처리했을 때 •OH를 각각 4.1, 8.3, 13.7, 28.4, 51.9, 72%까지 감소시켰다. 백금 나노 콜로이드의 농도가 50 ppm이상에서는 농도의존적인 감소를 나타냈으며.  농도가 증가할수록 •OH 소거능의 효과가 높게 나타났다 (Fig5).    

α, α-diphenyl-β-picrylhydrazyl (DPPH•) 소거에 미치는 영향: 백금 나노 콜로이드가 free radical인 DPPH•를 소거할 수 있는지를 조사하였다. 백금 나노 콜로이드 6.3~200 ppm 처리했을 때 DPPH소거 활성이 각각 1.7, 3.4, 7.3, 18.6, 25.7, 72. 9%로 증가하였다. 백금 나노 콜로이드의 농도가 13 ppm 이상에서는 농도의존적인 소거 활성을 나타냈으며, 농도가 증가할수록 DPPH 소거 활성 효과가 높게 나타났다 (Fig6). 

 Nitric oxide 소거에 미치는 영향: 백금 나노 콜로이드가 ROS의 중간 매개자인 NO를 소거할 수 있는지를 조사하였다. 백금 나노 콜로이 6.3~25 ppm 처리했을 때 NO를 각각 37.79, 34.53, 30.60%까지 유의적으로 감소시켰다 (Fig7).  

이들 결과는 백금 나노 콜로이드가 활성 산소종 및 자유 라디칼 소거능을 가진 강력한 항산화 물질임을 시사하고 있다.   

2) Ex-vivo 에서 산화적 스트레스로 유도된 세포 손상에 대한 백금 나노 콜로이드의 방어효과

H2O2로 유도된 세포 독성에 미치는 영향: LDH (lactate dehydrogenase)는 세포에 손상을 유도하는 물질(ex, drugs)에 의해 세포막으로부터 유리되며 세포 손상의 지표로 사용된다. H2O2로 산화적 세포손상을 유도하였을 때 백금 나노 콜로이드가 세포 손상을 보호하는지를 LDH cytotoxicity assay를 수행하여 조사하였다. 백금 나노 콜로이드를 6.3~100 ppm 처리했을 때 H2O2로 유도된 세포 손상을 각각 35.8, 35.4, 42.5, 65.2, 80.7%까지 유의적으로 감소시켰으며, 백금 나노 콜로이드의 농도가 높을수록 세포 손상에 대한 보호효과가 큰 것으로 나타났다 (Fig. 8). 

 H2O2로 유도된 지질 과산화 (Lipid peroxidation, LPO)에 미치는 영향: H2O2와 같은 ROS는 세포막의 손상을 유발하여 지질과산화를 야기시킨다. 따라서 본 실험에서는 H2O2로 산화적 스트레스를 유도하여 백금 나노 콜로이드가 지질과산화를 억제시킬 수 있는지를 조사하였다. 백금 나노 콜로이드를 12.5, 25 ppm처리했을 때 H2O2로 유도된 지질 과산화를 각각 32, 33%까지 유의적으로 감소시켰으며, 백금 나노 콜로이드의 농도가 높을수록 지질 과산화를 억제하는 효과가 큰 것으로 나타났다 (Fig. 9). 

 이들 결과는 백금 나노 콜로이드의 항산화 활성이 ex vivo에서도 나타날수 있으며, 즉, 백금 나노 콜로이드가 산화적 스트레스로 유도되는 간 세포막 지질성분의 산화를 차단하여 간 세포의 손상을 막아줄 수 있음을 시사한다.   

3) in-vivo에서 CCl4로 유도된 간 손상에 대한 백금 나노 콜로이드의 보호 효과

In vitro와 ex vivo에서 ROS와 free radical 소거능과 산화적 스트레스로 유도된 세포 손상에 대한 백금 나노 콜로이드의 항산화 효과가 인정되었으므로, 본 실험에서는 백금 나노 콜로이드가 산화적 스트레스 유도에 흔히 사용되는 CCl4모델을 사용하여 in vivo에서도 항산화 효과를 나타내는지를 조사하였다. 

 CCl4 주입에 따른 생존율에 대한 백금 나노 콜로이드의 방어 효과: 8주령의 male C57BL/6 mice (n=4)에 20% CCl4 0.5 ml/kg Bw을 일주일에 2회 구강 주입하여 백금 나노 콜로이드가 생존률에 미치는 영향을 조사하였다. CCl4 주입 4일 후 대조군에서 생존율 50%감소, 5일째 25%까지 감소한 반면 백금 나노 콜로이드를 공급한 실험군에서는 CCl4 주입 7일 후 75%의 생존율을 보여, 백금 나노 콜로이드가 CCl4로 유도된 독성에 대한 방어 효과가 있는 것으로 나타났다 (Fig. 10). 

 CCl4 주입 시 간 손상 정도를 나타내는 생화학적 지표에 대한 백금 나노 콜로이드의 방어 효과: 8주령의 male C57BL/6 mice (n=4)에 CCl4 0.5 μl/kg Bw을 복강 주사하여 간 손상을 유도하였을 때 간 손상에 대한 생화학 마커인 GOT, GPT, γ-GTP, ALP에 대한 백금 나노 콜로이드의 보호 효과가 있는지를 plasma에서 조사하였다. CCl4 주입 후 대조군에 비해 water 군에서 GOT 레벨이 12.9배까지 증가하였고 실험군에서는 증가된 GOT레벨을 18.4% 감소시켰으며 (Fig. 11A), GPT레벨은 대조군에 비해 water 군에서 26.7배까지 증가하였고 실험군에서는 증가된 GPT레벨을 22.5% 감소시켰다 (Fig. 11B). CCl4 주입 후 대조군에 비해 water 군에서 γ-GTP 레벨이 3.1배까지 증가하였고 실험군에서는 증가된 γ-GTP 레벨을 65.3%까지 감소시켰으며(Fig. 11C), ALP 활성은 대조군에 비해 water 군에서 1.4배 증가하였고 실험군에서는 증가된 ALP 활성을 31.9%까지 감소시켰다 (Fig. 11D). 

CCl4 주입 시 유도되는 지질 과산화에 대한 백금 나노 콜로이드의 방어 효과: 8주령의 male C57BL/6 mice (n=4)에 CCl4 0.5 μl/kg Bw을 복강 주사하여 간 손상에 따른 지질 과산화에 백금 나노 콜로이드의 보호 효과를 조사하기 위해 TBA assay를 수행하였고 지질 과산화 정도는 지질 과산화의 산물인 MDA (malon dialdehyde)를 protein 레벨로 나누어 나타내었다. 대조군에 비해 water군에서 CCl4 주입 후 간에서의 지질 과산화가 2.4배까지 증가하였고, 실험군에서는 증가된 지질 과산화를 22%까지 유의적으로 감소시켰다 (Fig. 12).   

CCl4 주입 시 유도되는 염증성 분자 발현에 대한 백금 나노 콜로이드의 영향 : 8주령의 male C57BL/6 mice (n=4)에 CCl4 0.5 μl/kg Bw을 복강 주사하여 간 조직 손상에 따른 염증반응에 대한 백금 나노 콜로이드의 효과를 조사하기 위해, 염증성 마커인 COX-2, iNOS 발현정도를 측정하였으나, 백금 나노 콜로이드 투여에 따른 COX-2, iNOS 유전자 발현 변화는 관찰되지 않았다 (Fig. 13). 

CCl4 주입 시 유도되는 간 손상에 대한 백금 나노 콜로이드의 보호 효과: 8주령의 male C57BL/6 mice (n=4)에 CCl4 0.5 μl/kg Bw을 복강 주사하여 간 조직 손상에 대한 백금 나노 콜로이드의 효과를 histochemistry assay를 통해 조사하였다. CCl4를 주입하지 않은 정상군에서는 central vein이 뚜렷하게 관찰되며, 주위 조직과 핵도 뚜렷이 관찰되었다. CCl4주입한 대조군에서는 중심 정맥 주위로 간 조직의 괴사가 넓게 일어났고 핵이 여러 개로 쪼개져 있는 것이 관찰된 반면 백금 나노 콜로이드를 공급한 실험군에서는 중심 정맥 주위의 간 조직 괴사가 water그룹에 비해 현저하게 감소된 것을 관찰할 수 있었다 (Fig. 14). 

 이러한 결과들은 백금 나노 콜로이드가 in vivo에서도 활성 산소종 및 자유 라디칼 생성 소거작용을 나타낼 수 있음을 시사하며, 이러한 항산화 작용은 CCl4 에 의한 간 세포의 산화적 손상을 억제하는데 기여했을 것으로 사료된다. 백금 나노 콜로이드가 간 보호효과가 있음을 시사하고 있다.   

 백금 나노 콜로이드이 염증성 매개자 생성에 미치는 영향: LPS로 자극된 대식세포로부터 염증성 매개자 NO 생성 및 사이토카인 TNFa 생성에 미치는 영향을 조사한 결과, 백금 나노 콜로이드는 LPS로 4시간 자극한 대식세포로부터 의 NO생성을 촉진하는 경항을 나타냈으며, 24시간 자극한 대식세포에서는 반대로 NO 생성을 억제하는 경향을 나타냈다 (Fig. 15). 한편, LPS로 24시간 자극된 대식세포에서는 백금 나노 콜로이드의 영향이 나타나지 않았으나, 4시간 자극된 대식세포에서의 TNFa 생성은 93ppm 백금 나노 콜로이드 처리에 의해 약 15% 감소되었으며, 다른 농도에서도 약간 감소하는 경향을 보였다. 그러나, LPS 자극없이 platinum nanocolloid를 단독 처리시 상당량의 TNFa 가 생성됨을 확인하였으며 (Fig. 15), 백금 나노 콜로이드 자체가 대식세포를 자극할수 있음을 알수 있었다. 현재, LPS 로 자극된 대식세포 모델계에서 백금 나노 콜로이드의 항염증 활성은 기대했던 것 보다 미미한것으로 평가된다. 그러나, 백금 나노 콜로이드 자체가 대식세포를 자극하여 활성화를 유도할 수 있는 점으로 보아, 백금 나노 콜로이드는 대식세포 등의 면역세포의 활성화가 유리하게 작용하는 감염 또는 암 모델계에서 계속 연구될 필요가 있다. 즉, 백금 나노 콜로이드는 감염이나 암 발생을 예방/억제하는데 유용한 물질일 가능성이 높아 보이며, 향후 이와 관련된 연구가 기대된다.  

참 고 문 헌

1. Coyle, J. T., and Puttfarcken, P. (1993) Oxidative stress, glutamate, and neurodegenerative disorders. Science 262, 689-695

2. Frank, H., and Link, B. (1984) Anaerobic metabolism of carbon tetrachloride and formation of catabolically resistant phospholipids. Biochem Pharmacol 33, 1127-1130

3. Bokov, A., Chaudhuri, A., and Richardson, A. (2004) The role of oxidative damage and stress in aging. Mech Ageing Dev 125, 811-826

4. Hampton, M. B., Kettle, A. J., and Winterbourn, C. C. (1998) Inside the neutrophil phagosome: oxidants, myeloperoxidase, and bacterial killing. Blood 92, 3007-3017

5. Sen, C. K. (1995) Oxidants and antioxidants in exercise. J Appl Physiol 79, 675-686

6. McCay, P. B., Lai, E. K., Poyer, J. L., DuBose, C. M., and Janzen, E. G. (1984) Oxygen- and carbon-centered free radical formation during carbon tetrachloride metabolism. Observation of lipid radicals in vivo and in vitro. J Biol Chem 259, 2135-2143

7. Halliwell, B., and Gutteridge, J. M. (1985) The importance of free radicals and catalytic metal ions in human diseases. Mol Aspects Med 8, 89-193

8. Reddrop, C. J., Cheeseman, K. H., and Slater, T. F. (1983) Correlations between common tests for assessment of liver damage: indices of the hepatoprotective activity of promethazine in carbon tetrachloride hepatotoxicity. Cell Biochem Funct 1, 55-63

9. Isono, R., Yoshimura, T., and Esumi, K. (2005) Preparation of Au/TiO2 nanocomposites and their catalytic activity for DPPH radical scavenging reaction. J Colloid Interface Sci 288, 177-183

10. Aiuchi, T., Nakajo, S., and Nakaya, K. (2004) Reducing activity of colloidal platinum nanoparticles for hydrogen peroxide, 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl radical and 2,6-dichlorophenol indophenol. Biol Pharm Bull 27, 736-738 

 11. Moure, A., Franco, D., Sineiro, J., Dominguez, H., Nunez, M. J., and Lema, J. M. (2000) Evaluation of extracts from Gevuina avellana hulls as antioxidants. J Agric Food Chem 48, 3890-3897
12. Sun, T., Xu, Z., Wu, C. T., Janes, M., Prinyawiwatkul, W., and No, H. K. (2007) Antioxidant activities of different colored sweet bell peppers (Capsicum annuum L.). J Food Sci 72, S98-102
13. Green, L. C., Wagner, D. A., Glogowski, J., Skipper, P. L., Wishnok, J. S., and Tannenbaum, S. R. (1982) Analysis of nitrate, nitrite, and [15N]nitrate in biological fluids. Anal Biochem 126, 131-138
14. Gutteridge, J. M. (1987) Ferrous-salt-promoted damage to deoxyribose and benzoate. The increased effectiveness of hydroxyl-radical scavengers in the presence of EDTA. Biochem J 243, 709-714
15. Adams, J. D., Jr., Lauterburg, B. H., and Mitchell, J. R. (1983) Plasma glutathione and glutathione disulfide in the rat: regulation and response to oxidative stress. J Pharmacol Exp Ther 227, 749-754
16. Constantin, M., Bromont, C., Fickat, R., and Massingham, R. (1990) Studies on the activity of bepridil as a scavenger of free radicals. Biochem Pharmacol 40, 1615-1622
17. Rekka, E., and Kourounakis, P. N. (1991) Effect of hydroxyethyl rutosides and related compounds on lipid peroxidation and free radical scavenging activity. Some structural aspects. J Pharm Pharmacol 43, 486-491
18. Halliwell, B. (1990) How to characterize a biological antioxidant. Free Radic Res Commun 9, 1-32
19. Marnett, L. J. (1999) Lipid peroxidation-DNA damage by malondialdehyde. Mutat Res 424, 83-95
20. Moore, L., Rodman Davenport, G., and Landon, E. J. (1976) Calcium uptake of a rat liver microsomal subcellular fraction in response to in vivo administration of carbon tetrachloride. J Biol Chem 251, 1197-1201

21. Hofmann, A. F., and Popper, H. (1987) Ursodeoxycholic acid for primary biliary cirrhosis. Lancet 2, 398-399
22. Frimpong, N. A., and Lapp, J. A. (1989) Effects of moderate alcohol intake in fixed or variable amounts on concentration of serum lipids and liver enzymes in healthy young men. Am J Clin Nutr 50, 987-991
23. Pilz, J., Meineke, I., and Gleiter, C. H. (2000) Measurement of free and bound malondialdehyde in plasma by high-performance liquid chromatography as the 2,4-dinitrophenylhydrazine derivative. J Chromatogr B Biomed Sci Appl 742, 315-325
24. Suttnar, J., Cermak, J., and Dyr, J. E. (1997) Solid-phase extraction in malondialdehyde analysis. Anal Biochem 249, 20-23
25. Suttnar, J., Masova, L., and Dyr, J. E. (2001) Influence of citrate and EDTA anticoagulants on plasma malondialdehyde concentrations estimated by high-performance liquid chromatography. J Chromatogr B Biomed Sci Appl 751, 193-197
26. Takeda, Y., Ichihara, A., Tanioka, H., and Inoue, H. (1964) The Biochemistry of Animal Cells. I. The Effect of Corticoteroids on Leakage of Enzymes from Dispersed Rat Liver Cells. J Biol Chem 239, 3590-3596