Results summary

Scientific results summary

In the first stage of the project, a literature study was carried out, analyzing the current situation regarding nosocomial infections, both in Romania and at the European level. The results of the study showed that nosocomial infections represent a major health problem at European level, with an important increase in the number of hospitalization days and associated mortality, respectively the costs required to treat infected patients. In Romania, nosocomial infections are underestimated due to inadequate reporting of these pathologies, underlining the importance of rapid and correct diagnosis of nosocomial infections. Bacteria have been shown to cause approximately 90% of these infections, with Pseudomonas aeruginosa being one of the most dangerous opportunistic pathogens involved in nosocomial infections.

P. aeruginosa is a Gram-negative, multidrug-resistant bacillus included on the World Health Organization's shortlist of critical, high-priority, antimicrobial-resistant pathogens – the ESKAPE group (E. faecium, S. aureus, K. pneumoniae, A. baumannii, P. aeruginosa, E. coli). The resistance of the pyocyanic bacillus to the action of antibiotics is caused by several factors, among which an important mechanism is represented by the formation of the biofilm. In addition to the multiple intrinsic resistance present in most strains, P. aeruginosa also shows great adaptability, making the eradication of this bacterium very difficult. Thus, the rapid and correct detection of this pathogen in clinical samples is very important, in order to establish the appropriate antibiotic treatment and for the eradication of the infection.

A systematic evaluation of recent analytical methods for the characterization and diagnosis of infections caused by P. aeruginosa was carried out within the project, demonstrating that the classical microbiological method (cultivation of bacteria on culture media and counting of the developed colonies) is still the most common method used for the detection of P. aeruginosa in clinical samples, even if this method presents a number of limitations such as the long analysis time (up to 48-72 h), the need for qualified personnel, the need for a large sample volume, special conditions for performing the analyzes and low specificity compared to other analytical methods. Thus, the project can help clinicians by developing sensitive and selective electrochemical methods for the detection of the P. aeruginosa, these methods overcoming the limitations of conventional methods. The proposed methods are based on the indirect detection of the bacterium, by means of small signaling molecules, which are involved in quorum sensing (QS) and in the formation of bacterial biofilm.

Quorum sensing (QS) is a form of interbacterial communication that allows individual cells to gather information about bacterial population density, enabling the switch to collective behavior. QS molecules are found in the extracellular environment in concentrations proportional to the bacterial population density, so their quantification in biological fluids could provide important information regarding the causative agent of the bacterial infection, but also about the stage of the infection. P. aeruginosa produces several QS molecules, our attention in this project being focused on acyl-homoserine lactone derivatives: N-butyryl homoserine lactone (C₄-HSL), N-3-oxo-dodecanoyl L-homoserine lactone (3-O-C₁₂-HSL) and on 2-heptyl-3-hydroxy-4-quinolone (PQS), a specific molecule for P. aeruginosa.

Within this project, different electrochemical sensors were developed for the detection of these molecules involved in quorum sensing in P. aeruginosa, and for the detection of c-di-GMP, a molecule involved in the biofilm formation, whose concentration in the extracellular environment can be correlated with the stage of biofilm formation, providing important information regarding the severity of the infection produced by this dangerous pathogen.

In order to increase the sensitivity of the detection method, carbon-based or gold-based nanomaterials were used, allowing the detection of small concentrations of the molecules of interest and, implicitly, of a small number of bacteria present in the sample. The developed sensors were also modified with molecularly imprinted polymers (MIPs) and aptamers, which are biomimetic systems specially synthesized to have an increased affinity towards the target molecules, thus providing increased selectivity to the detection method, which helps to correctly identify bacterial species present in the sample. The project developed the first MIP-based sensors for molecules involved in QS using electropolymerizable monomers, the first electrochemical aptasensor for 3-O-C₁₂-HSL and the first portable electrochemical sensor modified with nanomaterials for ultra-sensitive detection of PQS.

The sensors developed within the project demonstrated increased analytical performance, being able to detect in just a few minutes low analyte concentrations (below the usual concentrations in biological fluids and microbiological cultures), without interference from other molecules present in the analyzed samples and requiring very small samples. Also, the applicability of the sensors was tested in the detection of the molecules of interest in real samples (urine samples, human serum and nutrient broth spiked with the analyte and bacterial culture samples), the results indicating their possible use for the detection of the P. aeruginosa, respectively for the identification of infections produced by this dangerous pathogen from the early stages.

The developed sensors confirmed a proportional relationship between the bacterial population density in culture media and the concentration of QS molecules, demonstrating a possible use of these sensors for determining the stage and severity of the infection. Also, by using sensors for the detection of c-di-GMP, the presence/absence of the bacterial biofilm, respectively its stage of evolution, can be determined. All this information regarding the infection status produced by P. aeruginosa can be obtained in a simple and fast way using the developed sensors. Thus, based on this information, a correct and effective treatment can be quickly established, the methods developed in this project demonstrating a much reduced analysis time than in the case of conventional methods currently used in clinical laboratories. Another advantage of the methods developed in this project is represented by the simplicity of using electrochemical sensors, they can be used even by unqualified personnel.

The results presented in this project represent an important starting point for the development of point-of-care devices that allow the rapid detection of these bacteria at the patient's bedside, in the early stages of the infection, thus allowing the establishment of an appropriate treatment that prevents complications and reduces the number of hospitalization days, respectively the associated mortality.

Rezumatul rezultatelor științifice obținute

În prima etapă a proiectului a fost realizat un studiu de literatură, fiind analizată situația actuală privind infecțiile nosocomiale, atât la nivelul țării noastre, cât și la nivel European. Rezultatele studiului au arătat că infecțiile nosocomiale reprezintă o problemă majoră de sănătate la nivel European, cu o creștere importantă a numărului zilelor de spitalizare și a mortalității asociate, respectiv a costurilor necesare pentru tratarea pacienților infectați. În România, infecțiile nosocomiale sunt subestimate din cauza unei raportări necorespunzătoare a acestor patologii, subliniind importanța diagnosticării rapide și corecte a infecțiilor nosocomiale. S-a demonstrat că bacteriile provoacă aproximativ 90% dintre aceste infecții, Pseudomonas aeruginosa fiind unul dintre cei mai periculoși agenți patogeni oportuniști implicați în apariția infecțiilor nosocomiale.

P. aeruginosa este un bacil Gram negativ, multirezistent, inclus pe lista scurtă a Organizației Mondiale a Sănătății a agenților patogeni critici, cu prioritate ridicată, rezistenți la antimicrobiene - grupul ESKAPE (E. faecium, S. aureus, K. pneumoniae, A. baumannii, P. aeruginosa, E. coli). Rezistența bacilului piocianic la acțiunea antibioticelor este cauzată de mai mulți factori, printre care un mecanism important este reprezentat de formarea biofilmului. Pe lângă rezistența intrinsecă multiplă prezentă la majoritatea tulpinilor, P. aeruginosa prezintă și o mare adaptabilitate, eradicarea acestei bacterii fiind foarte dificilă. Astfel, detecția rapidă si corectă a acestui agent patogen este foarte importantă în probele clinice, pentru stabilirea tratamentului antibiotic adecvat și pentru eradicarea infecției.

O evaluare sistematică a metodelor analitice recente pentru caracterizarea și diagnosticarea infecțiilor cauzate de P. aeruginosa a fost realizată în cadrul proiectului, demonstrându-se că metoda clasică microbiologică (cultivarea bacteriilor pe mediile de cultură și numărarea coloniilor dezvoltate) este în continuare metoda cea mai frecvent utilizată pentru detectarea P. aeruginosa în probele clinice, chiar dacă această metodă prezintă o serie de limitări precum timpul lung de analiză (până la 48-72 h), necesitatea unui personal calificat, necesitatea unui volum mare de probă, condiții speciale pentru efectuarea analizelor și specificitate scăzută comparativ cu alte metode analitice. Astfel, proiectul vine în ajutorul clinicienilor prin dezvoltarea unor metode electrochimice sensibile și selective de detecție a bacilului P. aeruginosa, aceste metode depășind limitările metodelor convenționale. Metodele propuse se bazează pe detecția indirectă a bacteriei, prin intermediul unor molecule mici de semnalizare, care sunt implicate în sensibilitatea la cvorum (QS), respectiv în formarea de biofilm bacterian.

Sensibiliatea la cvorum (QS) este o formă de comunicare interbacteriană, care permite celulelor individuale să adune informații despre densitatea populației bacteriene, permițând trecerea la un comportament colectiv. Moleculele QS se găsesc în mediul extracelular în concentrații proporționale cu densitatea populației bacteriene, astfel cuantificarea lor din fluide biologice ar putea oferi informații importante privind agentul cauzal al infecției bacteriene, dar și despre stadiul infecției. P. aeruginosa produce mai multe molecule QS, atenția noastră în acest proiect fiind focusată pe pe derivații de acil-homoserin lactonă: N-butiril homoserine lactone (C₄-HSL), N-3-oxo-dodecanoil L-homoserin lactona (3-O-C₁₂-HSL) și pe 2-heptil-3-hidroxi-4-chinolona (PQS), moleculă specifică pentru P. aeruginosa.

În cadrul acestui proiect au fost dezvoltați diferiți senzori electrochimici pentru detecția acestor molecule implicate în sensibilitatea la cvorum în P. aeruginosa, și pentru detecția c-di-GMP, moleculă implicată în formarea biofilmului, a cărei concentrație în mediul extracelular poate fi corelată cu stadiul de formare al biofilmului, oferind informații importante privind gravitatea infecției produse de acest agent patogen periculos.

Pentru a crește sensibilitatea metodei de detecție au fost utilizate nanomateriale pe bază de carbon sau pe bază de aur, permițându-se detecția unor concentrații mici în moleculele de interes și implicit, a unui număr mic de bacterii prezente în probă. Senzorii dezvoltați au fost, de asemenea, modificați cu polimeri imprimați molecular (MIP) și aptameri, acestea fiind sisteme biomimetice special sintetizate pentru a avea o afinitate crescută față de moleculele țintă, oferind astfel o selectivitate crescută metodei de detecție, ceea ce ajută la identificarea corectă a speciei bacteriene prezente în probă. S-au dezvoltat în cadrul proiectului primii senzori pe bază de MIP pentru moleculele implicate în QS utilizând monomeri electropolimerizabili, primul aptasenzor electrochimic pentru 3-O-C₁₂-HSL și primul senzor electrochimic portabil modificat cu nanomateriale pentru detecția ultra-sensibilă de PQS.

Senzorii dezvoltați în cadrul proiectului au demonstrat performanțe analitice crescute, putând detecta în doar câteva minute concentrații mici de analit (sub concentrația uzuală din lichidele biologice și din culturile microbiologice), fără interferențe din partea altor molecule prezente în probele analizate și fiind necesare cantități foarte mici de probă. De asemenea, a fost testată aplicabilitatea senzorilor în detecția moleculelor de interes din probe reale (probe de urină, ser uman și bulion nutritiv îmbogățite cu analit și probe de culturi bacteriene), rezultatele indicând o posibilă utilizare a acestora pentru detecția bacilului P. aeruginosa, respectiv pentru identificarea infecțiilor produse de acest patogen periculos încă din stadii incipiente.

Senzorii dezvoltați au confirmat o relație de proporționalitate între densitatea populației bacteriene din mediile de cultură și concentrația moleculelor QS, demonstrând o posibilă utilizare a acestor senzori pentru determinarea stadiului și gravității infecției. De asemenea, prin utilizarea senzorilor pentru detecția c-di-GMP se poate determina prezența/absența biofilmului bacterian, respectiv stadiul de evoluție al acestuia. Toate aceste informații privind statusul infecției produse de P. aeruginosa pot fi obținute într-un mod simplu și rapid utilizând senzorii dezvoltați. Astfel, pe baza acestor informații se poate stabili rapid un tratament corect și eficient, metodele dezvoltate în acest proiect demonstrând un timp de analiză mult mai redus decât în cazul metodelor convenționale utilizate în mod curent în laboratoarele clinice. Un alt avantaj al metodelor dezvoltate în acest proiect este reprezentat de simplitatea de utilizare a senzorilor electrochimici, aceștia putând fi utilizați chiar și de personal necalificat.

Rezultatele prezentate în acest proiect reprezintă un punct de plecare important pentru dezvoltarea unor dispozitive portabile ce permit detecția rapidă a acestor bacterii la patul pacientului, în stadii incipiente ale infecției, permițând astfel instituirea unui tratament corespunzător care să prevină apariția complicațiilor și care să reducă numărul zilelor de spitalizare, respectiv mortalitatea asociată.