Protein Engineering Lab

비천연아미노산을 이용한 단백질공학이란?

◯ 20개의 표준아미노산으로 구성된 단백질은 생물의 세포 안에서 합성되어 생체 속에서 행하여지는 거의 모든 화학 반응의 촉매하고 생명체의 핵심 구성물질임. 20개의 표준아미노산의 제한된 구조와 기능기를 넘는 새로운 기능기를 갖는 비천연아미노산을 이용하여 단백질을 재설계하고 엔지니어링하는 것을 말함.

'비천연아미노산을 이용한 단백질공학'의 중요성

◯ 환경 친화적인 생촉매 반응을 이용하여 기존 유기화학반응 대체하거나 기존화학반응으로 불가능한 새로운 반응공정을 개발하는 것은 생물공학의 핵심분야 중 하나임. 자연계에 존재하는 효소의 개량의 방법인 방향성진화(2018 노벨 화학상 수상)와 이성적 디자인을 통한 효소 엔지니어링의 최근 놀라운 성공에도 불구하고, 근본적으로 그 최적화는 제한된 기능기를 갖는 20개의 표준 아미노산으로 제한됨.

◯ 지난 20년 동안 유전자 코드를 재프로그래밍하는 기술이 크게 발전하여 이제 수백 개의 비천연아미노산을 단백질에 고효율로 도입할 수 있게 되었음.

◯ 이러한 20개의 표준아미노산으로 이루어지는 전통적인 단백질(효소)개량과 달리 다양한 새로운 기능기를 갖는 비천연아미노산을 추가적으로 이용하는 비천연단백질공학은, 레고블럭의 다양성이 증가할수록 풍부한 디테일로, 더 자유롭게 원하는 모델을 만들 수 있는 레고의 조립과 같이, 전통적인 효소공학의 한계점을 뛰어넘는 방법론을 제시함.

◯ 이에 따라 비천연단백질공학은 효소의 활성, 안정성, 위치특이성, 광학선택성 등을 향상 시키는 것은 물론 손쉬운 방향성 고정화를 가능하게 하기때문에 차세대 단백질 공학의 도구가 될 것임. 방향성진화와 이성적디자인두 접근법을 넘어서는 차세대 효소엔지니어링 방법으로 대두되고 있음.

◯ 비천연아미노산에 새로운 유전자 코드를 부여함으로써, 20개의 표준 아미노산으로 제한된 생체 시스템을 벗어나 21개 또는 그 이상의 아미노산에 의존적인 생체 시스템을 구축할 수 있음. 이는 생명체의 진화적 관점에서 과연 비천연아미노산이 기능적으로 더 향상된 생명체를 만드는 데 활용될 수 있을지에 대한 의문을 해결해 나간다는 점에 의의가 있음.

◯ 외부 화학 자극에 반응하는 비천연아미노산을 효소와 같은 특정 기능성 단백질의 핵심 잔기에 도입을 하면 외부 신호 감응성 생체 재료를 개발할 수 있으며 이는 생체 내부(in vivo) 및 외부(in vitro)에서 모두 구현 가능함.

◯ 생체 대사 산물 및 여러 화학 물질과 독립적으로 반응성을 가지는 작용기를 비천연아미노산에 도입하여 항체와 같은 유용한 단백질에 도입을 한 후 저분자 의약품 또는 형광 저분자와 반응을 시키면 단백질-저분자 접합체를 매우 효율적으로, 위치 선택성을 갖도록 제작할 수 있음. 이는 항체-의약품 접합체(antibody-drug conjugate, ADC) 개발에 바로 응용할 수 있는 매우 유용한 방법임.

◯ 생물직교반응성을 가진 비천연아미노산을 위치선택적으로 단백질 치료제혹은 항체에 도입하면 감소시키지 않으면서 다른 분자 (항암약물, 고분자, 다른 단백질, 나노메디신, 형광물질 등)과 효율적으로 결합을 할 수 있어서 단백질 치료제 혹은 항체의 결합체 개발의 새로운 방법론을 제시함.

◯ 생체 내 비천연아미노산 도입기술을 이용하면 비천연아미노산에 의존적인 병원균 또는 바이러스를 만들어낼 수 있음. 비천연아미노산 의존적 병원체를 사람에게 미량 투여하면 야생형과 매우 유사하기 때문에 면역시스템을 자극하여 항체 생성을 효과적으로 유도할 수 있음. 사람에게는 비천연아미노산을 도입하는 체계가 없으므로 증식은 불가능하기에 독성은 최소화할 수 있음. 이는 생백신 개발의 새로운 패러다임으로 매우 유용하게 활용할 수 있는 전략임.

국내외 연구 동향

■ 국외

◯ 잔기특이적으로 도입된 새로운 기능기는 단백질을 개량하는 대표적인 예는 다음과 같음. 메티오닌 영양요구 균주를 이용하여 아자이드 기능기가 있는 비천연아미노산(azidohomoalanine)을 단백질 내 도입하고 다시 아자이드 기능기를 이용하여 스타우딩거 라이게이션(Staudinger ligation)에 의해서 선택적으로 단백질을 변형하거나, 알킨(alkyne) 기능기에 구리(I)-촉매 고리화반응을 통하여 단백질을 변형하는 연구를 수행하였음. 케톤기가 있는 비천연아미노산(p-acetylphenylalanine)을 단백질 내 도입하고, 이 케톤 기능기를 이용하여 생리활성 조건에서 바이오틴을 단백질에 연결(conjugation)할 수 있었음.

◯ 잔기 특이적으로 비천연아미노산을 리파아제, 리파제, 인산트리에스테라제, 유기인산 가수분해효소, 오메가-트랜스아미나제, DNA 중합효소 등에 도입하여 단백질의 열적 안정성을 증대시킨 보고가 있음. 비천연아미노산를 도입하여 P450, 베타갈락토시다제, 글루타티온전이효소, 엔도뉴클레아제 의 활성을 증대시킬 수 있었음.

◯ 미국 Scripps Research Institute의 Schultz 그룹은 하나의 종결코돈을 선택하고 그 코돈에 비천연아미노산을 도입하는 원천기술을 개발하였으며, 이를 확장하여 다양한 규주유래의 (예, Methanococcus jannashi) 아미노아실티알렌에이합성효소(예, tyrosyl-tRNA synthetase)의 뮤턴트를 이용하여 아지도(azido), 케톤, 요오드 등을 포함하는 200 여개 이상의 비천연아미노산을 성공적으로 단백질 내에 인비보 도입하였음.

◯ 위치특이적 비천연아미노산을 도입하여 단백질-단백질 상호작용에 관한연구, 효소의 반응 메커니즘을 규명할 수 있었음. 비천연아미노산을 도입하여 NMR 연구에 사용하였음. 하지만 이와 같은 연구는 효소의 특성 개량보다는 비천연아미노산을 이용하여 구조-기능의 연구에 사용한 사례에 해당됨. 비천연아미노산를 도입하여 니트로환원효소(nitroreductase)와 P450의 효소 활성을 증대 시키거나, 효소 반응의 위치특이성의 변경에 성공하였음. 디케토리덕타제(diketoreductase)에 도입하였을 경우, 해당 효소의 광학선택성을 변형할 수 있었음. 또한 특이적인 예로 광반응성 비천연아미노산를 다양한 효소 (예, caspase, kinase1, beta-galctosidase)에 도입하여 해당효소의 활성을 빛으로 제어하는데 성공하였음.

◯ 비천연아미노산 의존적 박테리아 또는 바이러스를 만드는 연구가 근 10년간의 연구에서 태동되고 있음. 박테리아를 비천연아미노산에 의존적으로 만들기 위해 미국 University of Texan at Austin 의 Ellington 연구 그룹에서는 베타 락탐 가수분해 효소(β-lactamase)를 3-나이트로-L-타이로신(3-nitro-L-tyrosine, 3nY) 또는 3-아이오도-L-타이로신(3-iodo-L-tyrosine, 3iY)에 의존적으로 만들어서 보고한 바 있음. 미국 Yale University의 Isaacs 연구 그룹에서는 3개의 단백질(SerS, MurG, DnaA)에 TAG 코돈을 삽입하여 매우 낮은 탈출 빈도(<10-11)를 가지는 균주를 만들었음. 이 균주는 혈액, 토양을 비롯한 여러 환경에서 비천연아미노산인 pAzF가 있을 때만 생존하는 특성을 나타내었음. 미국 Harvard University의 Church 연구 그룹에서는 고분자 모델링을 위한 로제타(Rosetta) 소프트웨어를 사용하여 단백질 구조를 재설계하였고, 이를 이용해 비천연아미노산에 의존적인 생물 안전 밀폐 시스템을 개발하였음. 미국 Scripps Research Institute의 Schultz 그룹은 금속 결합 잔기의 대체, 핵심 아미노산 전구체의 코돈 재할당, 또는 단백질-단백질 상호 작용면의 개발을 통해 비천연 아미노산에 의존적인 미생물 개발에 성공하였음. 중국 북경대의 Zhou 연구 그룹은 비천연아미노산을 필수요소로 하는 인플루엔자 A 바이러스를 개발하여 인플루엔자 A 바이러스 생백신의 프로토타입을 제시한 바 있음.

■ 국내

◯ 비천연아미노산을 이용한 단백질의 고정화에 성공함. 비천연아미노산(DOPA)이 도입된 GFP를 이용하여 단백질을 고정화 할 수 있는 가능성을 확인하였고, 산화제(NaIO4)로 비천연아미노산을 산화시킨뒤, 키토산 비드에 공유결합으로 고정화 될 수 있음을 확인함. 형광단백질에 비천연아미노산(HPG)를 도입하고 아자이드를 갖고 PEG와 구리(I)-촉매 고리화반응을 통하여 단백질을 PEG로 개질 할 수 있었고, 열적안정성이 급격하게 증가됨을 확인함. 비천연아미노산 도입을 통한 효소의 용해도를 급격히 증대 시킬수 있었음.

◯ 잔기특이적 도입법과 위치특이적 도입법의 조합을 통하여 두 개의 비천연아미노산을 한 단백질내에 동시에 도입하는 방법을 확립함.

◯ 효소의 고정화는 효소 상용화에 중요한 요소임. 그런데 효소의 활성 부위가 드러나게 고정화를 하면 활성이 높게 유지된다고 알려져 있음. 이를 구현하기 위해 반응성을 가진 비천연아미노산을 사용하는 데 단백질을 정제하고 고정화를 진행하면 비용이 크게 증대됨. 경제적인 효소 고정화를 구현하기 위해 미생물에서 발현된 단백질을 정제 단계 없이 생물직교반응을 이용하여 고정화할 수 있는 기술을 개발함.

◯ 단백질 치료제는 체 내에서 반감기가 짧아서 환자에게 자주 주사를 해야 되고 치료 비용이 높다라는 단점을 가지고 있음. 이를 해결하기 위해서 합성고분자인 PEG를 결합하여 왔었는데 무작위적인 위치에 PEG이 결합되어 치료제의 약효를 크게 감소시켜 왔음. 이러한 문제를 해결하기 위해 PEG을 대체하여 독성과 면역원성이 없는 인간 알부민 단백질을 직접 단백질 치료제에 결합하거나 알부민 리간드 (지방산 등)를 단백질 치료제의 특정 위치에만 결합하는 방법을 개발함. 생물직교성 반응성을 가진 비천연아미노산을 단백질 치료제 (통풍치료제인 요산분해효소, 당뇨치료제인 글루카곤 유사 펩타이드 등)의 특정 위치에 도입한 후 알부민 리간드링 지방산 혹은 알부민을 직접 결합하여 약효를 유지하면서 체 내 반감기를 크게 증대시킴.

◯ 단백질 치료제에 비천연아미노산을 클릭화학을 이용해서 인간 알부민 단백질을 결합할 때 반응속도가 낮아서 결합 효율이 낮은 문제를 해결하기 위해서 반응성이 아주 높은 테트라진 비천연아미노산을 단백질 치료제에 위치선택적으로 도입하는 기술을 개발함. 이를 이용하여 현재까지 보고된 생물직교반응 중 최고의 반응 속도를 구현했고, 단백질 치료제에 알부민 결합 수율을 100% 가까이로 높였음.

◯ 테트라진 비천연아미노산의 높은 반응성과 크게 향상된 생물직교반응 속도를 이용해서 체 내에 도입된 단백질에 약물이나 형광체에 해당되는 저분자 화합물을 결합 수율 100%에 가깝게 원하는 시간에 결합할 수 있는 기술을 개발하여 체 내에서 효율적으로 약물을 결합하거나 체 내 이미징을 할 수 있는 길을 열었음.

Reference; NIH