N-SPC 非RI細胞障害性アッセイキット（N-SPC Non-Radioactice Cellular Cytotoxicity Assay Kit）は、細胞障害性CD8陽性αβ型キラーT細胞、γδ型T細胞、NK細胞などの免疫エフェクター細胞が、腫瘍細胞やウィルス感染細胞などの標的細胞を障害し、細胞死を誘導する際に、その比細胞障害率（％）を非RI系で定量するために開発されたキットです。

標的細胞障害の際、細胞質からの標識キレート剤の漏出を時間分解蛍光法で測定することにより、非RIで細胞障害性を定量化することができます。

本キットで用いられている標識キレート剤は、標的細胞障害の際、速やかに細胞外に漏出するため、従来の[51Cr]クロミウムリリース法より迅速に測定が可能になっています。 免疫エフェクター細胞と標的細胞との混合培養時間は、従来の[51Cr]クロミウムリリース法では通常4時間ですが、本キットでは40分となっています。

原理

  1. BM-HT Reagentを腫瘍細胞やウイルス感染細胞などの標的細胞にパルスする。
  2. BM-HT Reagentが標的細胞内のエステラーゼにより加水分解され、HTキレートが生成する。
  3. NK細胞などの免疫エフェクター細胞が標的細胞を傷害すると、HTキレートが培養液に迅速に漏出する。
  4. 上清にEu Solutionを添加すると、HT/Eu複合体が形成される。
  5. HT/Eu複合体をレーザー光で励起すると、時間分解蛍光が観測される。

特徴

  1. BM-HT Reagentの加水分解産物であるHTキレートは、従来のEuキレート剤と比較し、自然漏出が少ない。
  2. BM-HT Reagentの加水分解産物であるHTキレートは、従来のEuキレート剤と比較し、蛍光強度が高い。
  3. BM-HT Reagentの加水分解産物であるHTキレートは、漏出速度が大きいため、細胞障害性測定の際のエフェクター細胞/標的細胞混合培養時間が40分であり、4時間の培養時間が必要な従来の[51Cr]クロミウムリリース法より迅速に測定が可能である。
  4. 放射性同位元素を使用せず細胞障害性試験を行うことができる。

用途

  • 細胞障害性CD8陽性αβ型キラーT細胞が腫瘍細胞を標的とするアッセイ
  • Vγ2Vδ2 （別名Vγ9Vδ2）陽性γδ型T細胞が腫瘍細胞を標的とするアッセイ
  • NK細胞がNK感受性細胞であるK562細胞などを標的とするアッセイ
  • γδ型T細胞やNK細胞などのFc受容体を発現する免疫キラー細胞が抗体でオプソニン化されたがん細胞などを標的とするアッセイなど

RI (51Cr)を用いた細胞障害性アッセイでは、放射能汚染を避けるために、サンプルのピペッティングやボルテックスによる混和を避ける必要があるため、サンプル間の値にばらつきが多い。非RIアッセイにおいては、サンプルの混和を頻繁に行うことができるため、サンプル間の誤差が低い。

また、51Crの細胞外漏出にかかる時間は4時間と比較的長いが、HTキレートの細胞外漏出は速いため、細胞障害アッセイの反応時間は40分程度にまで短縮できる。

※ 腫瘍細胞株やウィルス感染細胞株によっては、HTキレート剤の自然漏出速度が大きい場合がありますので、そのような場合には、添付のプロトコールを修正する事前検討実験が必要になる場合があります。なお、細胞内エステラーゼ活性の低い細胞種に関しても本アッセイキットを用いることができないため、事前検討が必要になります。

※ N-SPC非RI細胞障害性アッセイキットは、10回分の測定に必要な試薬を含んでおり、-80℃及び、4℃で保存可能です。また、測定には時間分解蛍光測定装置が必要です。

参考文献

Tanaka Y, Iwasaki M, Murata-Hirai K, et al. Anti-tumor activity and immunotherapeutic potential of a bisphosphonate prodrug. Sci Rep. 2017;7:5987.

Tanaka Y, Sakai Y, Mizuta S, et al. Live cell labeling with terpyridine derivative proligands to measure cytotoxicity mediated by immune cells. ChemMedChem. 2017;12:2006-2013.

Senju H , Kumagai H , Nakamura Y, et al. Effect of IL-18 on the Expansion and Phenotype of Human Natural Killer Cells: Application to Cancer Immunotherapy. 2018; 14(3): 331-340. doi: 10.7150/ijbs.22809

田中義正 がん免疫療法と非RI細胞障害能測定法アレルギーの臨床933 2018年5月号

キット構成

1. BM-HT Reagent 100 μL × １本 －80℃保存

2. Detergent 2 mg × 10本 4℃保存

3. Eu Solution 100 mL × 3本 4℃保存

4. DMSO 4 mL × 1本 4℃保存

5. H2O 8 mL × 2本 4℃保存

購入方法

本製品の購入については、(株)テクノ・スズタのホームページ（https://www.technosuzuta.co.jp/publics/index/115/)をご確認下さい。