原始文章 : https://www.beckman.tw/resources/reading-material/application-notes/how-violet-side-scatter-enables-nanoparticle-detection

在流式細胞儀的應用領域中，當樣品中顆粒的尺寸小於所用偵測光波的波長時，其偵測難度隨之劇增。此一現象歸因於基本的光學原理：顆粒所產生的散射光強度與其直徑呈正比，卻與偵測光波的波長成反比。此物理關係可從兩大經典光散射理論獲得印證 ──  (1) Mie 散射理論 : 適用於顆粒尺寸接近光波長的情境； (2) Rayleigh 散射理論 : 適用於顯著小於光波長之粒子。因此，與傳統藍光（488 nm）相比，波長更短的紫光（405 nm）能於相同粒徑條件下產生更強烈的側向散射訊號，進而拓展偵測解析的下限，使原本難以觀測的極微小粒子得以被辨識。此外，當光線進入折射率與原介質不同的環境時，其折射程度亦與波長成反比 ── 波長愈短，折射現象愈顯著。此現象最早由 Isaac Newton 於 1704 年觀察到，他透過稜鏡將白光分解為彩虹般的連續光譜，發現紅光的折射角度最小，而紫光則最大（Newton, 1704）。基於上述物理特性，紫光可有效強化粒子與其周遭介質間的折射率差異，顯著提升對低折射率微粒之偵測能力，例如胞外體（exosomes）、微囊泡（microvesicles），以及二氧化矽奈米粒子（silica nanoparticles）等。此篇由 Beckman Coulter 團隊撰寫的文章，詳細說明如何透過紫光側向散射（Violet Side Scatter, VSSC）設定 CytoFLEX 流式細胞儀，以實現對極微小粒子的高靈敏度偵測。

【紫光側向散射 VSSC 設定指南】

在 CytoFLEX 流式細胞儀上啟用紫光側向散射（Violet Side Scatter, VSSC）偵測功能，其操作步驟簡便，依下列流程即可完成設定：

1. 進入偵測器設定 : 開啟 CytExpert 軟體後，點選選單列中的「Cytometer」頁籤，選擇「Detector Configuration（偵測器設定）」。

2. 修改濾光片與通道名稱 : 在設定視窗中，將原本配置於 450 nm 通道的濾光片更換為 405 nm 濾光片，並將該通道重新命名為 VSSC。

3. 套用並啟用新的偵測組態 : 儲存設定後，選擇此組態為當前使用配置。

4. 更換濾光片實體位置 : 於儀器上，將 405 nm 濾光片安裝至原先 450 nm 濾光片的位置。

5. 重新啟動實驗流程 : 為套用新配置，重新啟動一次實驗流程，即可進入微粒偵測階段。

6. 設定觸發條件以提升偵測靈敏度 : 開啟「Acquisition Settings（資料擷取設定）」選單，將 VSSC 設為主要 Trigger Channel。

7. 使用 Height 提升微粒辨識力 : 選擇「Height（高度）」而非「Area（面積）」作為事件判別依據，以利辨別低訊號微粒。

8. 調整觸發閾值（Trigger Level）: 手動調整觸發門檻，直至能清楚區分目標訊號與背景雜訊。建議以最小可偵測粒子作為參考標準。

在固定的雷射強度與增益設定下，CytoFLEX 的觸發閾值表現通常具有高度一致性，無論是不同實驗間，亦或不同天次操作皆然。

*How to Set Up Violet Side Scatter Vedio : https://www.beckman.tw/resources/videos/tutorials/cytoflex-how-to-set-up-violet-side-scatter

【從雜訊中辨識真實訊號】

實際觀測微粒過程中，注意下列重要細節:  (1) 調整直方圖視角，避免壓縮小粒子訊號 : 務必調整 VSSC 直方圖的顯示範圍，使其聚焦於欲分析的粒徑區段。當鎖定適當範圍後，切換至對數刻度（Log Scale），可更清楚呈現多峰型粒徑的分布情形。(2) 設定門檻，以實際粒子作為基準 : 使用實驗中可取得的最小可偵測粒子作為參考樣本，並以其與背景訊號間的清晰區分作為觸發閾值的設定依據。待明確辨識出真實事件後，使用者可根據接受範圍適度放寬觸發門檻，以提升靈敏度，但仍需保持訊號的穩定性與準確性。(3) 控制雜訊與捨棄率 : 若觸發閾值設得過低，會因雜訊量增加而導致資料捨棄率（abort rate）上升。因此，盡可能將捨棄率控制於 5–10% 以下，這可透過調整觸發閾值、降低樣本濃度或減緩流速等方式實現。此外，為避免因粒子「群聚」（swarming）而產生實驗假象，建議維持低樣本濃度與低流速。

【樣本前處理的關鍵考量】

以流式細胞儀進行微粒與奈米粒子分析時，樣品的前處理需格外謹慎，以確保資料的準確性與再現性。首先，樣品懸浮的緩衝液應通過具有適當分子量截斷（molecular-weight cutoff, MWCO）之濾膜進行過濾，以去除可能與目標粒子尺寸範圍重疊的背景雜質。其次，在進樣前不宜劇烈搖晃樣品，以避免產生氣泡。因為氣泡亦會折射光線，進而在儀器中被誤判為有效事件，干擾訊號判讀。此外，許多人工合成之小型粒子傾向聚集成團，形成粒徑異常的聚合體（aggregates），這些聚集現象可能導致偵測錯誤，甚至被儀器視為無效事件而遭到排除。對於氣泡與聚集這兩種常見干擾，建議於分析前以超音波震盪（sonication）處理樣品，有助於將粒子分散均勻。惟需注意，超音波處理後應儘速進行分析，因聚集現象將隨時間重新發生，影響樣品分布。若樣品為生物來源且不適合使用超音波，則可改以機械性反覆吹吸（triturate）方式儘量分散樣品，以提升均勻性。最後，樣品濃度亦需進行滴定（titration），以確認最適的進樣範圍。過高的濃度不僅容易引發粒子聚集，亦可能造成「群聚效應」（swarming），進一步扭曲分析結果。

【測試 CytoFLEX 偵測奈米粒子的性能】

研究人員首先使用混合了 80 nm、200 nm與 500 nm聚苯乙烯微粒的 Duke 多重粒徑標準品，比較在 405 nm 紫光側向散射（VSSC）與傳統 488 nm 側向散射（SSC）下對奈米粒子之偵測靈敏度。結果顯示，VSSC 能清楚區分出 80 nm 與 200 nm 的微粒，而 SSC 則直到 200 nm 與 500 nm 之間才開始出現族群的可分辨性。透過計算前向散射 FSC、SSC 與 VSSC 偵測之粒子族群的訊雜比（signal-to-noise ratio），VSSC 在所有測得粒徑條件下的表現均優於 SSC。研究團隊進一步測試了折射率較低、較接近胞外體與微囊泡的二氧化矽奈米粒子，實驗結果顯示，CytoFLEX 可輕易辨識出 150 nm 與 200 nm 的二氧化矽微粒。

【結論】

透過紫光側向散射 VSSC 設定，CytoFLEX 流式細胞儀能清楚區辨出 80 nm 聚苯乙烯粒子與 150 nm 二氧化矽粒子，並有效將其自背景雜訊中分離出來。整體而言，VSSC 對於各種粒徑之奈米粒子的偵測與區辨能力，均優於傳統的 488 nm 側向散射 SSC。結果顯示，CytoFLEX 可藉由 VSSC 偵測 150 nm 的胞外囊泡（extracellular vesicles, EVs）。此外，先前研究指出，胞外囊泡的折射率與其粒徑呈負相關，即體積越小的囊泡，其折射率越高，約可達 1.6，接近聚苯乙烯粒子的折射率 1.59（Gardiner et al., 2014）。因此，VSSC 理論上或可應用於更小型 EVs（如 50 nm）。

參考文獻: 

1. Brittain, G. C., & Gulnik, S. How to Use Violet Side Scatter to Detect Nanoparticles on the CytoFLEX Flow Cytometer.

2. Gardiner, Chris, et al. "Measurement of refractive index by nanoparticle tracking analysis reveals heterogeneity in extracellular vesicles." Journal of extracellular vesicles 3.1 (2014): 25361.