Обратная транскрипция

Общие соображения:

· Ферменты хранятся только на льду, из холодильника (-20°) вытаскиваем их в последний момент

· Ферменты не вортексируем, только встряхивание пробирки пальцем

· После добавления ферментов в микс микс уже можно провортексировать (нежно)

· РНК должна быть как можно меньше при комнатной температуре, добавили РНК в пробы – убрали РНК в холодильник (-70°)

· Та проба РНК, которая была открыта, должна быть помечена на крышке эппендорфа знаком (звездочка, точка), отметить это в лабжурнале

· Перед началом работы смотрим, нет ли реактивов, которым надо размораживаться

· Размораживаем все на комнатной температуре, только воду mQ можно поместить в термостат ненадолго

· DTT и dNTP после размораживания хранить на льду

· Все, что размораживаем, вортексировать с осаждением капель на стенках

1. ДНКазная обработка:

· Рассчитываем, сколько матрицы и сколько воды mQ: 1 гамма матрицы (1 нг/1 мкл) на пробирку (чтобы посчитать V, делим 1000 на концентрацию нг (скорей мкг, Маша не права, мне кажется) /мкл), объем mQ=(8 мкл – объем матрицы)

· Пробирки подписываем «-» (минус-контроль)

· В пробирки доб. mQ, буфер (для ДНКазы, магний-содержащий, 1 мкл в пробу), матрицу и только затем ДНКазу (1 мкл в пробу)

· Легкий вортекс со сбрасыванием капель

· Инкубация 30 мин при 37° Цельсия

· Стоп-реакция: ЭДТА (1 мкл на пробу), вортекс, инкубация 10 мин при 65 град Цельсия

· Вортекс с осаждением капель

· После этого пробирки на лед или в холодильник (-70°)

2. Обратная транскрипция:

2.1. Отжиг праймеров:

· Подписываем новые пробирки «+» (плюс-контроль)

· В них доб по 1 мкл рандомного праймера, 3,5 мкл mQ и затем 5,5 мкл матрицы (после ДНКазной обработки), вортекс с осаждением

(причем пробирки с праймерами и водой готовлю заранее во время инкубации 30 мин при 37°)

· Инкубация 4 мин при 70°

· Вортекс с осаждением капель

2.2. Собственно обратная транскрипция:

· Заблаговременно (во время инкубации 30 мин при 37°) готовим микс из buffer5x (расчет 4 мкл на пробу), dNTP (расчет 2 мкл на пробу), DTT (расчет 2 мкл на пробу), mQ (расчет 0,5 мкл на пробу)

· В самый последний момент (во время инкубации 4 мин при 70°) в микс доб ревертазу MMLV (расчет 1 мкл на пробу) и ингибитор РНКазы (расчет 0,5 мкл на пробу), вортекс с осаждением капель

· В каждую пробу «+» доб по 10 мкл микса, нежный вортекс со сбрасыванием капель

· Инкубация 60 мин при 42°

· Разбавляем «-»-контрольные пробы до 160 мкл (то есть доб 154,5 mQ)

· Стоп-реакция: 10 мин при 70°

· Разбавляем «+»-контрольные пробы до 160 мкл (доб 40 мкл mQ)

· Убираем пробы в холодильник (-20°)