Экстракция РНК

1. Гомогенизация пробы

· Записываем номера проб в лабжурнал

· Достаем пробы из холольника (-70°С), помещаем на лед и несем к месту работы

· Как только извлекаем их изо льда, добавляем по 500 мкл реагента extract RNA

· Гомогенизируем пестиком, а затем пипетированием (стараемся делать это как можно быстрее)

2. Разделение фаз

· Добавляем 100 мкл хлороформа, инкубируем 3-5 мин при комнатной температуре, периодически перемешивая

· Центрифугируем 15 минут (12000 g) при 4°С, при этом подписываем новые пробирки

· В эти пробирки переносим 200 мкл супернатанта (водной фазы) из пробирок после центрифугирования, стараясь не дотрагиваться до белой фазы, старые пробирки выбрасываем

3. Выделение РНК

· Добавляем 300 мкл изопропанола, нежно перемешиваем, переворачивая пробы, инкубируем 10 мин при комнатной температуре, периодически перемешивая (где-то на уровне изопропанола добавляют гликоген, если концентрации низкие)

· Центрифугируем 10 минут (12000 g) при комнатной температуре (тут можно надолго оставить на холоду)

· Удаляем почти весь супернатант, добавляем к остатку 1 мл 75%-ного этанола, после этого аккуратно смываем изопропанол со стенок и крышки, не потеряв осадок из виду (после этого можно надолго оставить на холоду, если нужно прерваться)

· Центрифугируем 10 минут (12000 g) при комнатной температуре (тут можно надолго оставить на холоду)

· Удаляем почти весь супернатант, добавляем к остатку 1 мл 75%-ного этанола (после этого можно надолго оставить на холоду, если нужно прерваться)

· Центрифугируем 10 минут (12000 g) при комнатной температуре

· Делаем короткое центрифугирование на максимальном значении g, убираем остатки этанола

· Сушим осадок на воздухе до прозрачности

· Добавляем 40 мкл MQ, вортекс с осаждением капель

· Инкубируем 3-5 минут при 55°С, вортекс с осаждением капель

· Пробирки на лед

· Измеряем концентрацию на NanoDrop (перед этим верифицируем его, затем промываем платформу, устанавливаем бланк на нашей воде), добавляя по 1 мкл матрицы (не касаемся пипеткой платформы!)

· Хорошие значения:

для концентрации РНК – от 100 нг/мкл (в пробах мозга), но лучше к 1000 нг/мкл

для А260/А280=1,8-2,0

для А260/А230=2,0-2,4

· Делаем аликвоты: 10 мкл, 10 мкл, 19 мкл (пробирку с 19 мкл обозначаем точкой)

· Аликвоты убираем в холодильник на -70°С