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Técnicas PCR e interpretación de resultados
Técnicas PCR e interpretación de resultados
La Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) es un método de biología molecular creado en 1983 por el bioquímico Kary Mullis, transformando el ámbito de la biología y la genética al permitir la amplificación específica y exponencial de fragmentos de ADN, facilitando el análisis de los genes.
El objetivo principal de la PCR es amplificar un segmento específico de ADN, multiplicando un pequeño trozo hasta alcanzar cantidades suficientes para su posterior estudio. Esto es fundamental en múltiples aplicaciones, abarcando investigación genética, diagnóstico médico, criminología forense o biología evolutiva.
https://drive.google.com/file/d/1QrW_gj-0enFlyQMwtPaEDN_wEiPdwi_m/view
Componentes de la PCR
Componentes de la PCR
1. ADN Molde: Este es el ADN que contiene la secuencia objetivo que se desea amplificar (a partir de sangre, tejidos o incluso de estudios forenses). La contaminación de la muestra puede afectar la correcta amplificación del ADN, por lo que es preciso mantener su pureza y calidad.
2. Cebadores (Primers): Son oligonucleótidos (cortos fragmentos de ADN) que delimitan la región del ADN que se desea amplificar. Los cebadores se complementan con las secuencias del fragmento de interés que indican el inicio de la región amplificada por la ADN polimerasa.
3. ADN Polimerasa: Enzima que realiza la síntesis de ADN y la más utilizada en PCR. Esta enzima sintetiza una nueva hebra de ADN complementaria a la cadena molde a partir de los cebadores. La Taq polimerasa es termoestable, lo que significa que puede resistir las altas temperaturas utilizadas en la fase de desnaturalización sin desnaturalizarse y haciendo posible su uso durante más ciclos.
4. Nucleótidos (dNTPs): Los desoxirribonucleótidos trifosfatos son las unidades fundamentales (monómeros) del ADN que la ADN polimerasa utiliza para sintetizar la nueva cadena de ADN. Estos elementos se añaden en exceso al medio de reacción para ser integrados en las nuevas hebras de ADN durante la fase de elongación.
5. Buffer de Reacción: Proporciona el ambiente adecuado para la actividad de la Taq polimerasa e incluye MgCl2 (crucial para la actividad catalítica de la enzima).
https://drive.google.com/file/d/1QrW_gj-0enFlyQMwtPaEDN_wEiPdwi_m/view
ADN Molde
Cebadores (Primers) y ADN Polimerasa
Nucleótidos (dNTPs)
Buffer de Reacción
Etapas de la PCR y el papel de la temperatura
La PCR se realiza en ciclos que incluyen tres pasos de temperatura críticos. Una prueba de PCR típica consta de 25 a 35 ciclos, dependiendo de la cantidad de muestra inicial y de la finalidad. Cada ciclo consta de las siguientes fases:
1. Desnaturalización (94-98 °C): La desnaturalización es crucial para separar las dos hebras complementarias de la doble hélice de ADN para que cada hebra sirva como molde para síntesis nuevas. Este proceso se lleva a cabo a temperaturas entre los 94ºC y los 98ºC dividiendo así las hélices de ADN a través de la rumptura de los enlaces por puentes de hidrógeno sin alterar la estructura fosfodiéster.
2. Fase de Hibridación o Alineamiento (50-65 °C): Tras la desnaturalización, la reacción se enfría a una temperatura general de 50- 65ºC. Esta reducción de temperatura permite que los cebadores de oligonucleótidos se alineen de manera complementaria con las secuencias objetivo en las hebras del ADN molde.
3. Fase de Elongación o Extensión (72 °C): Una vez que los cebadores se han unido a las secuencias de ADN molde, la temperatura se asciende a unos 72°C (temperatura óptima para la Taq polimerasa). En esta etapa, la Taq polimerasa sintetiza una nueva hebra de ADN complementaria a cada hebra molde desde el extremo 3' de cada cebador.
https://drive.google.com/file/d/1QrW_gj-0enFlyQMwtPaEDN_wEiPdwi_m/view
Electroforesis
La electroforesis es una técnica de laboratorio que se diseñada para la separación de molécula (ADN, ARN o proteínas) según su tamaño y su carga (positiva o negativa). Esta técnica se basa en el diferente movimiento de las moléculas cargadas eléctricamente a través de la superficie hidratada de un medio sólido (gel de agarosa usualmente). Al hacer pasar una corriente sobre el medio, las moléculas con una carga negativa, se mueven hacia el ánodo (+), mientras que las moléculas con carga positiva, se ven atraídas hacia el cátodo (-).
Separación de fragmentos de ADN por electroforesis
1. Preparación del gel de agarosa: Se pesa la agarosa y se mezcla con un buffer de electroforesis (TAE o TBE). La mezcla se calienta hasta que la agarosa se disuelve completamente y queda transparente. Después se deja enfriar ligeramente, se vierte en un molde con un peine y se deja solidificar, formando los pocillos donde se cargará el ADN.
2. Preparación de las muestras de ADN: Las muestras de ADN se mezclan con un tinte de carga (loading dye), que permite que el ADN se hunda en los pocillos. También se prepara un marcador de peso molecular (DNA ladder) con fragmentos de tamaño conocido para tener referencia sobre su tamaño.
3. Sistema de electroforesis: El gel ya solidificado se coloca en la cubeta de electroforesis y se cubre completamente con buffer. Los pocillos deben quedar orientados hacia el polo negativo, ya que el ADN migrará hacia el polo positivo y la velocidad de la migración dependerá del tamaño de cada fragmento.
4. Carga de las muestras: Las muestras de ADN y el marcador de peso molecular se introducen cuidadosamente en los pocillos del gel mediante una micropipeta, evitando perforar el gel.
5. Aplicación de la corriente eléctrica (electroforesis): Se conecta la cubeta a una fuente de alimentación y se aplica un voltaje constante. El ADN, al tener carga negativa, migra a través del gel hacia el polo positivo. Los fragmentos pequeños se desplazan más rápido y recorren mayor distancia que los grandes.
6. Tinción y visualización del ADN: Una vez finalizada la electroforesis, el gel se tiñe con un colorante que se une al ADN y se observa bajo luz ultravioleta, donde los fragmentos aparecen como bandas fluorescentes.
7. Interpretación de resultados: Una vez finalizada la electroforesis y visualizado el gel bajo luz ultravioleta, se observan bandas de ADN fluorescentes. Cada banda corresponde a uno o varios fragmentos de ADN que tienen el mismo tamaño. Para interpretar los resultados, se comparan las bandas de las muestras con las bandas del marcador de peso molecular (DNA ladder) y, si una banda de la muestra se encuentra a la misma altura que una banda del marcador, se puede deducir que ambos fragmentos tienen un tamaño similar. Cuanto más lejos del punto de carga se encuentre una banda, menor tamaño tiene el fragmento de ADN. Cuanto más cerca del origen esté, mayor tamaño tiene el fragmento.
Gracias a esta comparación se puede determinar el tamaño aproximado de los fragmentos de ADN, comprobar si una PCR o una digestión enzimática ha funcionado correctamente o analizar la pureza de una muestra de ADN.
https://www.addgene.org/protocols/gel-electrophoresis/?utm
https://drive.google.com/file/d/1QrW_gj-0enFlyQMwtPaEDN_wEiPdwi_m/view
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