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微生物的染色法
實驗目的
微生物體型很小,菌體多為透明無色,無法以肉眼觀察,若將微生物製成懸浮液,置於顯微鏡下時,通常只能很小的菌體輪廓,且不易與背景(水)有所區別,對微生物構造及特性的膫解因此受到限制。如經染色處理,微生物細胞與周圍環境對比效果增加,易於檢視其大小、形狀、排列情形,亦可進一步鑑定不同微生物菌體的型態及結構。
原理—格蘭氏染色法
格蘭氏染色法主要是利用微生物的細胞壁差異以進行染色。格蘭氏陽性菌有著較厚的細胞壁,其肽聚醣層次多,交聯緻密,故遇脫水時網孔縮小,再加上不含類脂,使得乙醇不會溶出縫隙,因此阻隔了結晶紫-碘複合體的外滲,仍然呈紫色只能留在細菌體內。蘭氏陰性菌細胞壁層薄,外膜類脂含量高、肽聚糖層薄和交聯度差,在遇脫色劑時,以類脂爲主的外膜迅速溶解,薄而鬆散的肽聚糖網不能阻擋複合體溶出,因此會被脫色而成為無色。
微生物的染色
壹、實驗器材
實驗器材
1.鎳子 1支 2.酒精燈 1台 3.打火機 1把
4.載玻片 3片 5.蓋玻片 3片 6.蓋玻片(大) 1片
7.育有大腸桿菌的培養基 1個
8.育有枯草桿菌的培養基 1個 9.Pipetman 1支
10.Tip 適量 11.滴管 1支 12.染缸 1個
試劑
1.無菌水 適量 2.蒸餾水 適量 3.95%酒精 適量
4.Nigrosin染劑 適量 5.結晶紫 適量
6. 碘液 適量 7.番紅 適量
儀器
1. 正立光學顯微鏡(鏡油+拭鏡紙+99%酒精) 2台
結晶紫
番紅
Nigrosin染劑
碘液
貳
、
實驗步驟
(壹)、簡單染色法
1. 取0.01ml的的無菌水滴於乾淨玻片上。
2. 用tip沾取少許大腸桿菌與無菌水充分混合。
3. 快速在酒精燈上過火,使水分蒸發,完成熱固定。
4. 使用結晶紫染色劑滴加於大腸桿菌上。靜置約1分鐘。
5. 用蒸餾水把多餘的染劑沖洗至染缸中,應避免直接沖刷大腸桿菌。
6. 將多餘水分吸乾後,蓋上蓋玻片,即可觀察。
1000倍放大下的大腸桿菌
(貳)、負染色法
1. 滴加1滴Nigrosin染劑於玻片邊緣處。
2. 用tip沾取少量大腸桿菌與染劑混合。
3. 使用另一片玻片將染劑鋪平。
4. 蓋上玻片即可觀察。
透明白點處即為大腸桿菌(1000倍放大)
(參)、格蘭氏染色法
1. 將大腸桿菌和枯草桿菌用熱固定法固定於玻片兩端。
2. 使用結晶紫染劑,滴於大腸桿菌和枯草桿菌上並靜置約一分鐘。
3. 用蒸餾水將過多染劑洗入染缸中。
4. 滴上碘液(媒染液)並靜置約一分鐘。
5. 用蒸餾水沖洗。
6. 以95%酒精進行脫色作用,滴入酒精至染劑不再脫色為止。
7. 用蒸餾水將酒精洗入染缸中。
8. 滴上S番紅並靜置約三分鐘。
9. 用蒸餾水將過多染劑洗入染缸中。
10.輕拭玻片將水分吸乾,蓋上蓋玻片並用顯微鏡觀察。
大腸桿菌(格蘭氏陰性菌)呈現紅色。
枯草桿菌(格蘭氏陽性菌)則呈現藍色。
(兩者皆為1000倍放大下的畫面)
參、實驗心得
透過這次的實驗,學會了實用的染色技巧。過程中,也發現到許多看似簡單、制式化的染色流程,都有細節需要注重。像是染色的時間控制,細菌量的掌控,都是影響成敗的因素。期許自己能在將來運用自己的所學,來幫助微生物的觀察。
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