La insulina es una hormona polipeptídica formada por 51 aminoácidos, producida y secretada por las células beta de los islotes pancreáticos. Interviene en el aprovechamiento metabólico de los nutrientes, sobre todo en el anabolismo de los glúcidos.

La síntesis de la insulina pasa por una serie de etapas. Primero, la preproinsulina es creada por los ribosomas en el retículo endoplasmático rugoso. Esta pasa a ser, cuando pierde su secuencia señal, proinsulina. La proinsulina es importada al aparato de Golgi, donde se modifica, eliminando la parte central (péptido C) y uniendo los dos fragmentos restantes mediante puentes disulfuro, dando lugar a la insulina propiamente dicha.

Como se ha mencionado anteriormente, existen multitud de protocolos al alcance de nuestra mano para realizar la extracción del ADN de una muestra de sangre. Tras realizar una búsqueda se han encontrado varios laboratorios que ofrecen este tipo de kits con todo el material y la información necesarios para realizar este procedimiento, y al compararlos se ha optado por seleccionar el de Thermo Fisher Scientific. Esta empresa ofrece diferentes opciones, de entre las cuales seleccionamos el ChargeSwitch™ gDNA Serum Kit, 0.2-1 mL por los siguientes motivos:

• Su precio. El coste total del kit es de 201,00 EUR y ofrece una cantidad de 50 preparaciones, lo cual nos permite utilizar un gran número de muestras siendo a la vez bastante económico.

• Las cantidades de ADN con las cuales se va a trabajar son pequeñas y por tanto este kit se adapta bien a nuestras necesidades (permite aislar ADN de muestras de entre 10 y 20 µl de sangre).

• Para extraer la muestra de sangre se utilizarán las lancetas y el pinchador que utilizan las personas diabéticas. Obtendremos una cantidad suficiente de sangre ya que vamos a trabajar con unos 10-20 µl.

Una vez que obtenemos el ADN es importante conocer qué cantidad tenemos en un determinado volumen antes de realizar la PCR, ya que si hay un exceso de ADN este puede unirse de manera errónea a los cebadores. La cuantificación se puede llevar a cabo con un Nanodrop, un espectrofotómetro de UV visible de espectro completo utilizado para cuantificar y evaluar la pureza de ADN, ARN, proteínas, etc. Muchos laboratorios ofrecen este tipo de instrumento. Elegiremos el de la misma empresa que nos ha proporcionado el kit de extracción del ADN, Thermo Fisher Scientific. Nos ofrecen dos modelos (2000 y 2000c), con diferentes especificaciones, de los cuales podemos escoger cualquiera de los dos.

El siguiente paso una vez obtenido el ADN sería seleccionar el gen deseado, en este caso el de la insulina, y amplificarlo mediante una PCR. Lo primero que se necesita para llevar a cabo esta técnica es obtener los cebadores o primers. Para ello es necesario conocer la secuencia del gen de la insulina, por lo que utilizamos la base de datos nucleotide de NCBI. Realizamos la búsqueda y seleccionamos el gen de la insulina humana (accesion: AH002844 J00265 J00268).

Podemos observar que el gen (2186-4969) está formado por dos exones (2186-2227 y 3397-3615) y dos intrones (2228-2406 y 2611-3396), y que por tanto su región codificante es del 2424 al 2610 y desde el 3397 al 3542.

La reacción en cadena de la polimerasa (en inglés, polymerase chain reaction o PCR) es una técnica de la biología molecular cuyo objetivo es obtener un gran número de copias de un fragmento de ADN particular, partiendo de una muestra que contiene una cantidad mínima de ADN.

Los ingredientes clave para una reacción de PCR son Taq polimerasa, cebadores, ADN molde y nucleótidos (los bloques básicos del ADN). Los ingredientes se colocan en un tubo, junto con los cofactores que necesite la enzima, y se someten a ciclos repetidos de calentamiento y enfriamiento que permiten la síntesis del ADN.

Según indica la tabla, debemos preparar una disolución 10 µM de cada cebador y partimos de los 25 nmoles que hemos comprado. Estos 25 nmoles vienen liofilizados en un tubo de 1,5 mL. Una disolución 10 µM pasado a nM sería 10000 nM, de manera que deberíamos disolver los 25 nmoles en 2,5 ml de tampón (Tris-EDTA). Sin embargo, como hemos mencionado anteriormente el volumen máximo es 1,5 ml (tubo de cebadores). Para solucionarlo, los disolvemos en 0,25 ml, es decir, 10 veces más concentrado de lo que se requiere. A continuación, cerramos el tubo, lo agitamos y centrifugamos para mezclar la disolución

Como la disolución madre de cada cebador está diez veces más concentrada, tomamos 1 µl de esta disolución y añadimos 9 µl del tampón en otro tubo, obteniendo así 10 µl de disolución madre de cebador a la concentración requerida (10 µM). Es conveniente preparar una cantidad mayor de la estrictamente necesaria por si ocurre alguna contaminación en alguno de los tubos.

Al igual que hicimos con el ADN tras su extracción, es conveniente cuantificar también los cebadores por el mismo motivo, porque un exceso o un defecto de los mismos pueden afectar negativamente a la PCR. Aunque la empresa que nos los envía nos dice la cantidad (25 nmoles) este es un valor aproximado que puede no ser la realidad. Una vez realizadas las disoluciones explicadas en el apartado anterior, podemos utilizar el NanoDrop que usamos en la cuantificación del ADN.

La cantidad de ADN molde que debemos incluir deberá ser inferior a 1000 ng, pero no nos especifican cual. Con la cuantificación que realizamos al extraer el ADN con el NanoDrop obtendríamos la cantidad exacta de ADN de la que disponemos. En función de la concentración, será necesario añadir un volumen u otro al tubo de reacción. Suponiendo que la concentración es de 1ng/µl, añadiríamos 1µl de ADN molde para trabajar con 1ng por tubo de reacción de PCR.

Cuando realizamos PCR es importante tener en cuenta los siguientes puntos para evitar cualquier tipo de contaminación o deterioro de la muestra:

• NO utilizar ningún tipo de material que haya sido autoclavado, ya que la PCR es muy sensible a la contaminación por cualquier bacteria presente.

• Tener precaución a la hora de acumular aerosoles al absorber con la pipeta.

• Esto se soluciona obteniendo tubos nuevos especiales para su uso en PCR y puntas con filtro, que evitan la formación de dichos aerosoles.