In cadrul WP1, s-au efectuat activitatile preconizate in planul de realizare, incepand cu sintezele de nanoparticule stelate, prin metoda clasica bulk, precum si prin metoda imbunatatita in canale microfluidice. S-au putut obtine particule cu rezonanta plasmonica in intervalul 600-900 nm, in functie de rapoartele molare ale reactantilor, valori controlate prin concentratiile solutiilor utilizate, dar si prin debitul de pompare prin seringe pumps. Aceste particule au fost caracterizate si prin analiza imaginilor de microscopie electronica. S-a testat eficienta SERS a acestor particule cu 2 molecule reporter, care interactioneaza cu NP fie electrostatic (NB), fie prin formarea unei legaturi covalente Au-S (pATP) si s-au identificat concentratii pentru care semnalul SERS este maximizat.

S-a studiat bio-functionalizarea GNU, cu intentia de a optimiza functionarea lor ca senzori SERS de tip sandwich. Distanta inter-particule a fost scazuta pentru a facilita formarea de hotspot-uri SERS intre particule adiacente in prezenta analitului. Asadar, sistemul compus din GNU functionalizati cu Nile Blue (NB), PEG si anticorpi a fost inlocuit cu variante in care anticorpii au fost legati covalent direct de molecule reporter mici, 4-mercaptobenzoic acid (4MBA) si para-aminothiophenol (pATP), reducand la jumatate distanta intre spinii nanoaricilor adiacenti.

Din punct de vedere al platformelor microfluidice, s-a proiectat un sistem cu doua intrari, o zona de masurare, si o iesire, obtinut prin tehnici de frezare CNC, intr-o platforma solida de polymethyl methacrylate (PMMA). Acesta este conectat la un sistem de seringe pumps, care pompeaza concomitent solutii de nanoparticule bio-functionalizate si de analit. Un flux redus al acestor fluide permite interactiunea lor si masurarea spectrelor SERS.

Combinand GNU functionalizate cu platforma microfluidica, s-a obtinut un model capabil de recunoastere a proteinei biomarker CEA-CAM5, ca „proof-of-concept”, pe baza anticorpilor anti-CEA-CAM5 ce duc la o aglomerare a GNU, si la o amplificare SERS pentru unele benzi spectrale.

Prin inlocuirea anticorpilor cu aptameri, elemente de recunoastere moleculara superioare atat prin dimensiuni mai mici, stabilitate crescuta cat si costuri de productie reduse, se poate imbunatati distanta inter-particule pentru a facilita formarea de hotspot-uri SERS intre particule adiacente in prezenta analitului (proteina biomarker a bolii Alzheimer, denumita Tau441).

S-a identificat un protocol de incubare a GNU cu aptamer si cu molecula reporter 4MBA, pentru a obtine particule biofunctionalizare cu semnal SERS suficient, si recunoastere/legare eficienta a proteinei tinta.

GNU functionalizate au fost incubate impreuna cu solutii de proteina Tau441 de diferite concentratii relevante, iar semnalul SERS generat in urma interactiunii celor doua componente a fost masurat in proba lichida, precum si in sistemul microfluidic dezvoltat. S-au identificat benzile SERS pentru care semnalul moleculei reporter nu se suprapune cu semnalul substratului microfluidic de PMMA, si a caror intensitate se coreleaza cu cresterea concentratiei de proteina tinta.

GNU functionalizate cu aptamer au fost incubate cu solutii de proteina Tau441 solubilizate in lichid cefalorahidian simulat (simulated cerebrospinal fluid - sCSF). Concentratiile testate incadreaza valorile fiziologice si patologice ale proteinei Tau in lichidul cefalorahidian al pacientilor, rezultatele avand relevanta biologica.

Masuratorile s-au efectuat atat in probe lichide, cat si in sistemul microfluidic dezvoltat, care permite utilizarea unor volume mult mai mici din aceste probe, de nivelul microlitrilor.

S-a identificat banda SERS cheie pentru care semnalul moleculei reporter difera de semnalul substratului microfluidic, si a carei intensitate creste odata cu cresterea concentratiei de proteina.

Subliniem potentialul acestor rezultate de a fi un punct de pornire puternic in dezvoltarea sensorului propus, bazat pe o platforma microfluidica, detectie SERS, si nanoparticule de tip nanoarici de aur functionalizati cu aptameri pentru recunoastere specifica a biomarkerului tinta.