Testes de Coombs direto e indireto

Prof. Esp. Juliana Cogo

Introdução

Em 1945, Coombs, Mourant e Race produziram o soro de antiglobulina humana (IgG) a partir da injeção de soro humano ou seus componentes purificados em coelhos. Este soro obtido foi então incorporado à sorologia de grupos sanguíneos. A descoberta foi de grande importância para a medicina transfusional, e é utilizada para a detecção de hemácias sensibilizadas in vivo ou in vitro por aloanticorpos, autoanticorpos e/ou componentes do complemento.

A IgM e a IgG são os anticorpos de maior importância clínica relacionados aos grupos sanguíneos. Enquanto os anticorpos da classe IgM têm uma estrutura pentamérica e são capazes de aglutinar diretamente as hemácias, os anticorpos da classe IgG sensibilizam as hemácias sem causar aglutinação eritrocitária, sendo considerados “incompletos”. A detecção de hemácias sensibilizadas por IgG é realizada pela adição de antiglobulina humana (AGH) ou anti-IgG, que causa a aglutinação eritrocitária. A anti-IgG humana permite reconhecer a fração Fc do anticorpo fixado na membrana das hemácias sensibilizadas, dessa forma, formam uma ligação entre os anticorpos humanos, resultando no fenômeno da aglutinação.

A detecção da sensibilização das hemácias in vivo ou in vitro são realizadas pelos testes de antiglobulina direta (TAD), ou Coombs direto, e de antiglobulina indireta, ou Coombs indireto, respectivamente. Podem ser aplicados para os testes de compatibilidade, triagem de anticorpos irregulares, identificação de anticorpos irregulares, fenotipagem eritrocitária e estudos de titulação de anticorpos.

O teste de Coombs direto é considerado um método simples para detectar a sensibilização in vivo de hemácias com IgG e/ou componentes do complemento, de acordo com o soro de antiglobulina humana utilizado (Figura 1). É utilizado para a detecção de doença hemolítica do recém-nascido, reação transfusional hemolítica e anemia hemolítica autoimune.

Figura 1. Representação esquemática do teste de Coombs direto.

Fonte: adaptado de: http://www.lookfordiagnosis.com/mesh_info.php.

Por outro lado, no teste de Coombs indireto, utiliza-se anti-IgG para detectar a presença de anticorpos não ABO livres no soro/plasma do paciente (Figura 2). No teste, utiliza-se hemácias fenotipadas, contendo antígenos clinicamente importantes para os sistemas Rh, Kell, Kidd, Duffy, MNS, Lewis, P, Lutheran e, mais recentemente, a inclusão do antígeno Dia. Este teste é frequentemente utilizado para fenotipagem eritrocitária, pesquisa de anticorpos irregulares e para a prova de compatibilidade ou prova cruzada.

Figura 2. Representação esquemática do teste de Coombs indireto.

Fonte: adaptado de: http://www.lookfordiagnosis.com/mesh_info.php

Materiais e
Equipamentos

luvas;
tubos de ensaio;
estante para tubo;
pipetas e ponteiras;
solução fisiológica (NaCl: 0,9%);
cronômetro;
centrífuga;
banho-maria a 37 °C.

Amostras de sangue total e de soro.

Reagentes

Antiglobulina humana (soro de coombs).
Reagente de controle negativo (salina ou albumina).

POP

Teste de Coombs direto ou Teste da Antiglobulina Direto (TAD)

Amostras: sangue total

Procedimento:

Lavar as hemácias.

1.1. Adicionar 100 µL da suspensão de hemácias em um tubo de ensaio.

1.2. Adicionar 2 mL de solução fisiológica.

11.3. Centrifugar à 3000 r.p.m. por 1 min.

1.4. Desprezar o sobrenadante com cuidado para deixar o “botão” de hemácias no fundo do tubo.

1.5. Repita o processo mais duas vezes (totalizando 3 lavagens).

1.6. Na última vez, com o auxílio de um papel toalha, desprezar toda a salina.

1.7. Adicionar 1 mL de solução fisiológica ao tubo e agitar levemente para a homogeneização das hemácias.

1.8. Transferir 100 µL da suspensão de hemácias lavadas para um novo tubo de ensaio.

Adicionar 2 gotas do reagente de Coombs (anti-humano) no tubo com 100 µL da suspensão de hemácias lavadas e homogeneizar.

Centrifugar à 1000 r.p.m. por 1 min.

Realizar a leitura – agitar levemente o tubo e verificar se houve aglutinação das hemácias.

Teste negativo = quando não houver a formação de aglutinação visível.

Teste positivo = quando houver a formação de uma aglutinação visível.
Quando positivo, fazer a semiquantificação do resultado (0, +, ++, +++).

Teste de Coombs indireto ou Teste da Antiglobulina Indireto

Amostras: sangue total

Procedimento:

Lavar as hemácias.

1.1. Adicionar 100 µL da suspensão de hemácias em um tubo de ensaio.

1.2. Adicionar 2 mL de solução fisiológica.

1.3. Centrifugar 3000 r.p.m. por 1 min.

1.4. Desprezar o sobrenadante com cuidado para deixar o “botão” de hemácias no fundo do tubo.

1.5. Repita o processo mais duas vezes (totalizando 3 lavagens).

1.6. Na última vez, com o auxílio de um papel toalha, desprezar toda a salina.

1.7. Adicionar 1 mL de solução fisiológica ao tubo e agitar levemente para a homogeneização das hemácias.

1.8. 1.8. Transferir 100 µL da suspensão de hemácias lavadas para um novo tubo de ensaio.

Adicionar 100 µL do soro a ser testado no tubo de ensaio com 100 µL da suspensão de hemácias lavadas.

Homogeneizar e incubar em banho-maria a 37 °C por 30-45 min.

Lavar novamente as hemácias 3 vezes com solução salina (igual à etapa 2).

Adicionar 2 gotas do reagente de Coombs (anti-humano) e homogeneizar.

Centrifugar à 1000 r.p.m. por 1 min.

Realizar a leitura – agitar levemente o tubo e verificar se houve aglutinação das hemácias.

Teste negativo = quando não houver a formação de aglutinação visível.

Teste positivo = quando houver a formação de uma aglutinação visível.

Observação: no caso da prova de Coombs Indireta ser positiva, o soro deverá ser diluído em salina (1/2, 1/4, 1/8, 1/16 etc.) e repetir a prova em cada um dos tubos. O título será dado pela última diluição com resultado positivo (cuidado com “o fenômeno de zona”).

Na Prática

Verifique seu Aprendizado

1) O teste de antiglobulina pode ser utilizado na detecção de hemácias sensibilizadas por aloanticorpos, autoanticorpos e/ou componentes do complemento. A sensibilização pode ocorrer in vivo ou in vitro. A respeito do teste de Coombs indireto, analise as afirmativas a seguir:

I- A sensibilização in vitro em hemácias é determinada pela técnica de antiglobulina indireta ou Coombs indireto.

II- No teste de Coombs indireto, utiliza-se anticorpos anti-IgM humana.

III- O método em tubo é realizado após a adição de hemácias a serem testadas, previamente lavadas com solução fisiológica por 3 vezes, seguida da adição do reagente de antiglobulina humana.

IV- No teste de Coombs indireto, pesquisa-se tanto a presença de anticorpos IgM quanto IgG não aglutinantes.

Referente ao contexto apresentado, marque a alternativa que apresenta apenas afirmativas corretas:

a) I, apenas.

b) III, apenas.

c) II e III, apenas.

d) II, III e IV, apenas.

e) I, II, III e IV.

2) A doença hemolítica do feto e do recém-nascido (HDFN), também conhecida como HDFN aloimune ou eritroblastose fetal, é causada pela destruição dos glóbulos vermelhos do recém-nascido ou do feto.

A ocorrência da hemólise associada à incompatibilidade ABO está limitada às mães do grupo O, cujos filhos são do tipo A ou B. Ao contrário das mães do tipo A ou B, em que os anticorpos naturais são da classe __________ e não atravessam a barreira placentária, as do grupo O possuem anticorpos naturais predominantemente da classe IgG, que por sua vez atravessam a barreira placentária e podem ocasionar a doença em questão (MALONO, et al., 2004). A incompatibilidade ABO se caracteriza pela presença de aglutininas anti-A ou, mais raramente, anti-B no sangue.

A respeito do contexto e do texto apresentado acima, RESPONDA.

a) INDIQUE qual a palavra que completa adequadamente a lacuna deixada em branco no texto.

b) EXPLIQUE de que maneira o “Soro de Coombs” é utilizado para o diagnóstico de HDFN em amostras de sangue de recém-natos. INDIQUE se devemos realizar o teste DIRETO ou INDIRETO.

3) A identificação de anticorpos irregulares é de suma importância no rastreio aos doadores de sangue a fim de detectar eventuais aloimunizações, testes pré-transfusionais aos receptores de transfusões sanguíneas, assim evitando reações transfusionais. Para avaliarmos a presença destes anticorpos irregulares utilizamos o teste de Coombs. A respeito do teste de Coombs, MARQUE a alternativa correta:

a) Anticorpos irregulares são pesquisados em amostras de sangue total, através do teste de Coombs indireto.

b) Anticorpos irregulares são pesquisados em amostras de sangue total, através do teste de Coombs direto.

c) Anticorpos irregulares são pesquisados em amostras de soro do receptor, através do teste de Coombs direto.

d) Anticorpos irregulares são pesquisados em amostras de soro do receptor, através do teste de Coombs indireto.

e) Nenhuma afirmativa está correta.

Orientação de resposta

1) B - III, apenas

a) Imunoglobulina M – IgM.

b) O teste de Coombs permite detectar anticorpos maternos IgG para o antígeno D ligados às hemácias do feto ou do recém-nascido.

Teste de Coombs direto – utilizando amostra de sangue do feto ou do recém-nascido.

3) D - Anticorpos irregulares são pesquisados em amostras de soro do receptor a presença de anticorpos teste de Coombs indireto.

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