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Prof. Dra. Juliana Cogo
Introdução
Introdução
Diluição de amostras de soro para realização de testes imunológicos
Diluição de amostras de soro para realização de testes imunológicos
Soro e Plasma
Soro e Plasma
Várias dosagens imunológicas podem ser realizadas no SORO (obtido a partir de sangue sem anticoagulantes) ou no PLASMA (obtido de sangue com anticoagulantes). Como observado na Figura 1, a diferença analítica entre soro e plasma é que o primeiro não contém fibrinogênio, o qual foi utilizado para a formação do coágulo (fibrina).
Figura 1 – Imagem ilustrando as principais diferenças entre soro e plasma
Fonte: a autora.
Em determinados testes imunológicos há a necessidade de realizar a diluição de reagentes ou até mesmo da própria amostra do paciente. A amostra do paciente poderá ser diluída para: realizar a determinação semiquantitativa de antígenos ou anticorpos; evitar o desenvolvimento de resultados falso-negativos devido aos efeitos pró-zona e pós-zona.
Você pode identificar uma diluição de solução pela quantidade de soluto no volume total, expresso como uma proporção. Por exemplo, uma substância química pode ser preparada em uma diluição de álcool de 1/10 (1:10), indicando que um frasco de 10 mL contém 1 mL da substância (soluto) e 9 mL de álcool (diluente).
Por tanto, diluir é acrescentar solvente a uma solução mantendo-se inalteradas as quantidades de soluto existentes.
1 parte de soro
+ 9 partes de salina
10 partes de solução final
COMO CALCULAR O FATOR DE DILUIÇÃO
COMO CALCULAR O FATOR DE DILUIÇÃO
Qual o fator de diluição se você adicionar 2 mL de uma amostra a 18 mL de diluente?
1. Calcule o volume final da solução (volume de diluente + volume da alíquota)
2. Divida o volume final da solução pelo volume da alíquota
COMO PREPARAR UMA DILUIÇÃO
COMO PREPARAR UMA DILUIÇÃO
Qual o volume de amostra (alíquota) e diluente a ser adicionado para preparar uma diluição 1:10 em um volume final de 50 μL?
Determine o volume de alíquota necessário
Modo 1 - multiplique o volume final da solução pelo fator de diluição
Modo 2 – utilizando a regra de 3 simples
1 μL --- 10 μL
X μL --- 50 μL
2. Determine o volume necessário de diluente, para isso, subtraia o volume de alíquota do volume total da solução.
Volume de diluente = Volume final da solução - Volume de alíquota
Volume de diluente = 50μL - 5μL = 45μL
Então, em uma diluição de 1:10 com volume final de 50 μL, você usará 5 μL de alíquota (amostra) e 45 μL de diluente.
COMO REALIZAR DILUIÇÃO SERIADA
COMO REALIZAR DILUIÇÃO SERIADA
Diluição seriada é um método de diluição sucessiva com razão constante. Nesta técnica, transferem-se volumes sucessivos de um tubo para o tubo seguinte, ao qual se adiciona previamente a quantidade adequada de diluente.
Como realizar a diluição seriada de razão 1:2 de uma amostra de soro em que o volume final seja 500 μL.
1. Determinar o volume de diluente e de alíquota para preparar uma diluição 1:2 em um volume final de 500 μL.
2. Complete a tabela a seguir:
Determinação do título
Determinação do título
É a concentração de uma solução determinada por titulação. É a menor quantidade ou concentração que produz um efeito particular ou produto. O título é a recíproca da diluição. Então, em uma reação de pesquisa de anticorpos positiva na diluição ½ e ¼ e negativa na diluição 1/8 e 1/16, o título é 4.
Materiais e
Equipamentos
Materiais e
Equipamentos
Luvas.
Tubos ensaio.
Estante para tubos.
Agitador de tubos.
Pipetas e ponteiras.
Água ou Solução fisiológica (NaCl: 0,9%).
Azul de metileno.
POP
POP
Após completar a Tabela 1:
A concentração de uma solução pode ser determinada empregando o título.
Adicionar a todos os tubos o volume de diluente calculado.
Adicionar ao tubo 1 o volume de amostra calculado e homogeneizar 10 vezes a solução, utilizando a mesma pipeta e ponteira.
Transferir uma alíquota (mesmo volume de alíquota utilizado no preparo do tubo 1) do tubo 1 para o tubo 2 e homogeneizar a solução.
Prosseguir da mesma maneira até o tubo 8.
Descartar o volume excedente (mesmo volume de alíquota utilizado) do último tubo.
Figura 2 – Imagem ilustrando o processo de diluição seriada de amostra em tubos de ensaio
Fonte: a autora.
Para diluições seriadas, ao se calcular o título, é necessário multiplicar o fator de diluição do tubo inicial pela diluição realizada no próximo tubo.
Na Prática
Na Prática
Verifique seu Aprendizado
Verifique seu Aprendizado
1) Você acaba de receber um novo kit de imunofluorescência indireta para o diagnóstico de infecção pela bactéria Treponema pallidum. Durante a leitura do procedimento a ser realizado, há uma etapa que indica que a amostra de sangue deverá ser previamente diluída 1/10 em solução fisiológica para o uso. Sabendo disso, indique qual o volume de uma amostra de sangue que é necessário para se preparar uma solução de 1 mL. Indique qual o volume de diluente a ser utilizado.
2) Um dos reagentes presente no kit de Elisa é a solução de lavagem, o qual é utilizado para a remoção de todas as moléculas que não ficaram ligadas à placa. Segue a especificação de um destes tampões:
Solução de Lavagem Concentrada (25x): 1 frasco com 50 mL de Tampão Tris HCL contendo 0,1% Tween 20 e 0,1% ProClin TM 300 como preservativo.
Considerando as especificações apresentadas, e sabendo que você terá que diluir 1/25, indique qual o volume de água a ser utilizado para o preparo da solução.
3) Ao conhecer a respeito dos fundamentos e princípios dos imunoensaios, você já deve ter ouvido falar a respeito dos efeitos pró-zona e pós-zona, situações que podemos ter o aparecimento de resultados falso-negativos. Além disso, já deve ter percebido que alguns testes imunológicos são utilizados para a determinação semiquantitativa de determinados antígenos ou anticorpos. Sabendo disso, elabore um protocolo com o passo a passo para a diluição seriada de razão 1/10 em um volume de 500 µL.
Orientação de resposta
Orientação de resposta
1)
Volume de amostra: 100 µL
Volume de diluente: 900 µL
2)
Volume de amostra: 50 mL
Volume de diluente: 1200 mL
3)
Volume de amostra: 50 µL
Volume de diluente: 450 µL
Referências
Referências
ANVISA. Higienização das Mãos. 4 out. 2022. Disponível em: https://www.gov.br/anvisa/pt-br/assuntos/servicosdesaude/prevencao-e-controle-de-infeccao-e-resistencia-microbiana/higienizacao-das-maos. Acesso em: 24 out. 2022.
ANVISA. Resolução RDC nº 216, de 15 de setembro de 2004. Dispõe sobre Regulamento Técnico de Boas Práticas para Serviços de Alimentação. 2004. Disponível em: https://bvsms.saude.gov.br/bvs/saudelegis/anvisa/2004/res0216_15_09_2004.html. Acesso em: 24 out. 2022.
BRASIL. Higienização das Mãos em Assistência à Saúde. BVSMS – Biblioteca Virtual em Saúde, 2016. Disponível em: https://bvsms.saude.gov.br/higienizacao-das-maos-na-assistencia-a-saude/. Acesso em: 24 out. 2022.
CFN. Resolução CFN n° 600, de 25 de fevereiro de 2018.
Dispõe sobre a definição das áreas de atuação do nutricionista e suas atribuições, indica parâmetros numéricos mínimos de referência, por área de atuação, para a efetividade dos serviços prestados à sociedade e dá outras providências. 2018. Disponível em: https://www.cfn.org.br/wp-content/uploads/resolucoes/Res_600_2018. Acesso em: 24 out. 2022.
EBSERH. POP: Higienização das Mãos – Núcleo de Segurança do Paciente. Campina Grande: EBSERH, 2020.
ICS. Higienização das mãos. 10 mar. 2021. Disponível em: https://ics.curitiba.org.br/higienizacao-das-maos/. Acesso em: 24 out. 2022.
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