カシパン用whole mount in situ hybridizationプロトコル
参考文献:
Nakata and Minokawa (2009), Gene Expression Patterns 9, 152-157.
Minokawa et al. (2004), Gene Expression Patterns 4, 449-456.
Arenas-Mena et al. (2000), Development 127, 4631-4643.
固定:
胚を1.5ml遠心チューブに入れ、Fixative (あるいはCesar’s fixative)で固定する。4ºC、一晩。以下の行程は全て遠心チューブ中でおこなう。
固定液を捨て、胚を１ｍｌの MOPS Bufferで洗う。これを5回繰り返す。
胚を 70% ethanolに移し、-20ºCで保存。すぐに以下のステップに進む場合はエタノールに入れる必要はない。
ハイブリダイゼーション:
胚を1mlの MOPS Bufferで2回洗う。もし受精膜がついているなら、この段階で細いタングステン針などを使って受精膜を除去しておく。
ヨツアナカシパンのように胚が透明でない場合は0.03 %H2O2 in MOPS Bufferで室温、10~15分処理する。
胚を1mlの MOPS Bufferでさらに3回洗う。
プレハイブリダイゼーション： MOPS Bufferをできるだけ除去して、Hybridization Bufferを加える。 50~60ºCで3時間処理する。60℃では胚が変形する場合がある。そのような場合は50℃で。
ハイブリダイゼーション： 新しいHybridization Bufferを用意し、これにプローブを 100 ng/mlになるように加える。プレハイブリダイゼーションに使っているHybridization Buffer をできるだけ除去して、プローブ入りHybridization Buffer を加える。ハイブリは50あるいは60ºCで、最低3日、できれば一週間行う。
洗い:
Hybridization Bufferをできるだけ除去し、胚を１ｍｌのMOPS Bufferで室温、5回洗う。
MOPS Buffer をできるだけ除去し、チューブに1mlのHybridization Buffer (プローブを含まない)を加える。60ºCで3時間。
できるだけHybridization Buffer を除去して、1mlのMOPS Bufferで室温、3回洗う。
ブロッキング:
100µl 程度のBlocking Solution Iで室温、20分処理。
100µl 程度のBlocking Solution IIで37ºC、30分処理。
抗体処理:
Blocking Solution IIをできるだけ除去し、適当量の抗体バッファー（Antibody Dilution Bufferに、Rocheのアルカリフォスファターゼ標識抗DIG抗体を1/1500で希釈したもの）で処理する。室温、一晩。
１ｍｌの MOPS Bufferで5回以上あらう。1回の洗いには最低1時間かける。このステップの洗いには振とう機を使い、バッファーが緩やかに攪拌されるように。
Staining:
胚をチューブの底に集め、MOPS Buffer をできるだけ除去し、100µl 程度のAlkaline Phosphatase Bufferを加え、室温で30分処理。Alkaline Phosphatase Bufferには界面活性剤が入っていないので、チューブの壁に胚がくっつきやすくなるので注意。
30分後にバッファーを除去し、新しい Alkaline Phosphatase Buffer を100µl 程度加え、さらに30分処理。
Alkaline Phosphatase Buffer をできるだけ除去して、100µl 程度のStaining Solutionを加える。室温、遮光して、一晩、あるいは24時間反応させる。カシパンやウニの場合、24時間処理してもバックグラウンドはほとんど生じない。
充分に反応させたら１ｍｌの MOPS Bufferで2回以上洗う。50％ glycerolなどに移して、観察せよ。
試薬:
Fixative
4% paraformaldehyde*
32.5% FSW (or ASW)
32.5mM MOPS pH7
162.5mM NaCl
DEPC-treated H2O
MOPS Buffer
0.1M MOPS pH7
0.5M NaCl
0.1% Tween-20
DEPC-treated H2O
0.03 % H2O2 in MOPS Buffer
0.03 % H2O2
0.1M MOPS pH7
0.5M NaCl
0.1% Tween-20
DEPC-treated H2O
Hybridization Buffer
70% formamide
0.1M MOPS pH7
0.5M NaCl
0.1% Tween-20
1mg/ml BSA*
DEPC-treated H2O
Blocking Solution I
0.1M MOPS pH7
0.5M NaCl
10mg/ml BSA*
0.1% Tween-20
autoclaved H2O
Blocking Solution II
0.1M MOPS pH7
0.5M NaCl
10% sheep (goat) serum*
1mg/ml BSA*
0.1% Tween-20
autoclaved H2O
Antibody Dilution Solution
0.1M MOPS pH7
0.5M NaCl
1% sheep (goat) serum*
0.1mg/ml BSA*
0.1% Tween-20
autoclaved H2O
Anti-DIG antibody (Roche)
0.1M Tris pH9.5
50mM MgCl2
0.1M NaCl
1mM Levamisole
autoclaved H2O
10% dimethyl formamide
0.1M Tris pH9.5
50mM MgCl2
0.1M NaCl
1mM Levamisole
NBT*
BCIP*
autoclaved H2O
Parafromaldehyde=Electron Microscopy Sciences, Cat.#15710, Paraformaldehyde 16% solution.
Sheep serum=Sigma S7773, Sheep sera.
BSA=Sigma A4503, Albumin, bovine, initial fraction by cold alcohol precipitation Fraction V, dissolved in DEPC-H2O.
NBT=Sigma N6876 dissolved in 70% dimethyl formamide (DMF) (stock conc.: 75mg/ml). Keep it in –20C.
BCIP=Sigma B8503, dissolved in 100% DMF (stock conc.: 50mg/ml). Keep it in –20C.