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2013-2016

Contexte scientifique

L’équipe pour laquelle je travaillait, étudiait l'horloge circadien qui contrôle les rythmes de repos de Drosophila. Plus spécifiquement, ils essaient de caractériser le réseau neuronal qui génère les comportements de rythme, les circuits d’entrée qui apportent les informations de la lumière par le système visuel aux neurones de l’horloge et les circuits de sortie qui transmettent l’information de rythme de l’horloge aux centres qui contrôlent le sommeil et l’activité.

Comme la plupart des études comportementales, l’analyse des cycles sommeil-veille nécessite des outils pour manipuler une petite population de neurones pour comprendre comment ils contribuent spécifiquement à la fonction du réseau.

Les neurogénéticiens s’appuient sur des systèmes génétiques qui permettent de cibler l’expression des gènes dans des petites populations des cellules(ex : <50). Un nombre croissant de transgènes sont disponibles pour inhiber les cellules ou induire leur acivité neuronale, réguler négativement l’expression spécifique des genes ou mesurer les changements dans les niveaux de CA2 ou AMPc.

Le problème principal est donc de restreindre l’expression des genes aux sous ensembles de petites cellules pour l’analyse de circuits. Plusieurs systèmes d’expression binaire ont été développés et utilisés de manière intensive dans Drosophila, en utilisant le système Gal4/UAS (Brand et Perrimon , ) de la levure, le système bactérien lexA/lexAop (Szuts et Bientz, 2000) ou fongiques QF/QUAS (Potter et al., 2010). De grandes collections de lignées Gal4 ont été produites et, pour deux d’entre elles, des modèles d’expression correspondants dans le cerveau ont été imagés et mis à la disposition de la communauté scientifique (Jentt et al., 2012).

Comment restreindre davantage les modèles d’expression ? Les systèmes intersectionnels basés sur le ciblage séparé du domaine d’activation et du domaine de liaison à l’ADN ont été développés avec succès pour l’expression mais nécessitent de produire deux bibliothèques distinctes.

Une stratégie intéressante a été récemment utilisée pour restreindre les modèles d’expression Gal4 caractérisés en conduisant le domaine de liaison à l’ADN de lexA avec Gal4 (bibliothèques existantes) et en le combinant avec un domaine d’activation indépendant (nouvelle bibliothèque).

L’équipe a utilisé ce système dans les études de cycle circadien et nous croyons qu’il fournit un moyen efficace de générer facilement des modèles d’expression restreints.

Le plan a consisté donc à produire environ 5000 lignées « enhancer-trap » aléatoires portant un domaine d’activation qui porte une marquer fluorescent GFP et qui peut être combiné (interaction zip/ zip protéine) avec un domaine de liaison à l’ADN qui est déjà relié au Gal4, puis faire les images en utilisant un microscope confocal.

Ces images seront ensuite enregistrées dans un cerveau de référence permettant des comparaisons inter-modèles, par des annotations spatiales automatiques dans l’espace virtuel.

Mes responsabilités dans ce projet ont été les suivantes :

1. Générer les lignées transgéniques. Pour ça j’ai dû apprendre la théorie de la génétique de la mouche et de la mettre en pratique pour bien sélectionner et créer les lignées transgéniques. J'utilisais des outils génétiques et de biologie moléculaire pour créer des lignées transgéniques porteuses d'un rapporteur fluorescent sous le contrôle de différentes régions régulatrices du génome.

2. Améliorer le protocole de dissection et montage des cerveaux. Pour réduire le nombre des lames et pour adapter le montage pour un microscope droit, j’ai du créer des mini chambres en utilisant des œillets espaceurs dans lesquels j’avais disposé les cerveaux sur quatre lignes et trois colonnes pour avoir douze cerveaux par génotype. Sur une lame j’avais monté en moyenne six génotypes, ce qui m’a permis d’avancer dans l’obtention des images.

3. Tester et améliorer les protocoles d’immunomarquages déjà existantes. Utilisant un protocole publié dans la littérature, j’avais remarqué que l’intensité du signal fluorescent dans le centre des cerveaux il n’était pas homogène avec la partie périphérique. En changeant les temps d’incubation, les concentrations des anticorps et la concentration et les divers détergents de perméabilisation, j’ai arrivé à homogénéiser l’intensité du signal, ainsi leur qualité.

4. Administration et organisation des donnés obtenus sur le serveur de l’atlas.