Proyectos de Investigación

Proyecto SIA 0067-13: Proyecto financiado por recursos de Ley de Pesca.

Título: PURIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN MOLECULAR Y FUNCIONAL DE UNA NOVEDOSA HEMOLISINA DE LA ANÉMONA MARINA Anthopleura nigrescens: UNA HERRAMIENTA PARA EL ESTUDIO DE ESTRUCTURA-FUNCIÓN DE LAS ACTINOPORINAS Y SU POTENCIAL APLICACIÓN.

Las actinoporinas son toxinas formadoras de poros que las producen algunas anémonas marinas. Son proteínas básicas (pI 9-11), con masas moleculares de alrededor de 20 kDa y con alta afinidad por membranas que contienen esfingomielina. Se han reportado 30 actinoporinas pero, únicamente se ha determinado la secuencia aminoacídica de 15. Únicamente se ha determinado la estructura tridimensional de tres de ellas. Recientemente en el extracto crudo y en una fracción cromatográfica de la anémona marina Anthopleura nigrescens se detectó actividad hemolítica inhibible por esfingomielina. Además, en esta fracción activa se detectó una banda de alrededor de 20 kDa por SDS-PAGE. Ambos resultados nos sugiere que A. nigrescens posee almenos una actinoporina. El objetivo de este proyecto es purificar y caracterizar estructural (contenido de estructura secundaria) y funcionalmente la hemolisina que contiene el veneno de esta anémona. Para lograr el objetivo se hará uso de técnicas cromatográficas, espectroscópicas y de biología molecular. Este proyecto permitirá a la UNA desarrollar novedosos trabajos de caracterización molecular y funcional a nivel de proteínas.

Proyecto SIA 0173-16: Proyecto financiado por la International Foundation for Science (IFS)

Título: CLONING, PURIFICATION AND THE MOLECULAR AND FUNCTIONAL CHARACTERIZATION OF A NOVEL HEMOLYSIN FROM THE SEA ANEMONE Anthopleura nigrescens.

Sea anemones produce an ensemble of toxins employed for their defense against predators and preys capture. A family of these toxins with high cytolytic activity (nM concentration range) known as actinoporins has attracted the attention of the scientific community for their potential use in biomedicine. These proteins are basic and highly hemolytic pore-forming proteins with a molecular mass of around 20 kDa and high affinity for sphingomyelin (SM)-containing membranes. So far, more than 30 actinoporins have been reported, the amino acid sequence of twenty actinoporins have been determined, but only the 3D structure of equinatoxin II from Actinia equina, sticholysins I and II (St I/II) from Stichodactyla helianthus and fragaceatoxin C from Actinia fragacea have been solved. St I and St II with 93% sequence identity exhibit different permeabilizing activity indicating that subtle changes along this family can modulate their activity. With the first IFS Grant we have reported the Isolation and partial purification of a hemolytic sphingomyelin-inhibitable fraction from the sea anemone Anthopleura nigrescens. This project aims to continue with the purification, cloning and the molecular and functional characterization of at least one actinoporin from A. nigrescens, and to compare its properties with those of St I and St II to better understand the structure-function relationship of the novel actinoporin and in general of this protein family.

Proyecto SIA 0400-14: Proyecto financiado por Fondos del Sistema, liderado por la Universidad Nacional en el cual participan el Instituto Clodomiro Picado de la Universidad de Costa Rica y el Instituto Tecnológico de Costa Rica.

Título: AISLAMIENTO, PURIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN MOLECULAR Y FUNCIONAL DE UNA NOVEDOSA HEMOLISINA CON PROPIEDADES DE ACTINOPORINA DE LA ANÉMONA MARINA Anthopleura nigrescens: UNA HERRAMIENTA PARA EL ESTUDIO ESTRUCTURA-FUNCIÓN DE LAS ACTINOPORINAS Y SU POTENCIAL APLICACIÓN.

Este proyecto incursionará en un campo novedoso para el país, como lo es la investigación en moléculas proteicas de interés biomédico obtenidas de macroinvertebrados marinos, un recurso no explotado aún en nuestro país con estos fines. Propiamente, en el aislamiento, purificación y caracterización estructural y funcional de al menos una hemolisina con propiedades de actinoporina obtenida de la anémona marina Anthopleura nigrescens, en la cual se detectó actividad hemolítica inhibible por esfingomielina y en SDS-PAGE se evidenció una banda de alrededor de 20 kDa, características de las actinoporinas. Estas son una familia de proteínas producidas por anémonas de mar y que develan un potencial uso biomédico para el diseño de fármacos contra el cáncer y otras patologías. Un apropiado entendimiento de los mecanismos moleculares de acción de las actinoporinas podría contribuir a establecer las bases para la construcción racional de inmunotoxinas contra el cáncer u otras enfermedades, o para el diseño de novedosos sistemas farmacéuticos de liberación de sustancias al citosol celular.

Proyecto SIA 0400-14: Proyecto financiado por Fondos del Sistema, liderado por el Instituto Tecnológico de Costa Rica en el cual participa la Universidad Nacional y el Instituto Clodomiro Picado de la Universidad de Costa Rica.

Título: EVALUACIÓN DE LAS INTERACCIONES ENTRE FACTORES PROTEICOS QUE PARTICIPAN EN LOS PROCESOS DE COAGULACIÓN SANGUÍNEA MEDIANTE LA IMPLEMENTACIÓN DE ENSAYOS DE RESONANCIA MAGNÉTICA NUCLEAR (RMN) DE PROTEÍNAS EN SOLUCIÓN.

En esta investigación se incursionará en el novedoso campo de la resonancia magnética nuclear (RMN) para evaluar las interacciones entre dos de las principales proteínas que participan en los procesos cardiovasculares, el FVIII y la trombina, implementando técnicas de RMN de proteínas en fase líquida por primera vez en Costa Rica, y en los laboratorios del CIPRONA. Una vez implementadas, estas técnicas serán accesibles a la comunidad de investigadores (ITCR, UCR, UNA, UNED y CENIBiot) y sociedad en general siendo de utilidad para el análisis de interacciones entre prácticamente cualquier tipo de proteínas, redundando así en el incremento del nivel de investigación nacional. Este proyecto permitirá avanzar en el conocimiento de procesos moleculares que conllevan a la formación de coágulos sanguíneos, donde es sabido que los desajustes más severos en este proceso desencadenan serias enfermedades cardiovasculares, tales como infartos cardíacos y accidentes cerebrovasculares. En este sentido, los avances que se logren con este proyecto de investigación aportarán, a mediano o largo plazo, la posibilidad de desarrollar fármacos anti-trombóticos nuevos y más específicos que repercutirán en importantes beneficios sanitarios y económicos para la sociedad.

Proyecto SIA 0640-19: Proyecto financiado por Fondos del Sistema CONARE (FEES) liderado por la Universidad Nacional en el cual participa el Instituto Clodomiro Picado de la Universidad de Costa Rica.

Título: Clonaje, expresión y caracterización molecular y funcional de dos isoformas de nigrelisina, una actinoporina de Anthopleura nigrescens, una anémona del Pacífico costarricense.

Las actinoporinas son toxinas producidas por anémonas de mar que tienen la característica de formar poros en membranas celulares y en membranas modelos. Se caracterizan por poseer un peso molecular de ~20 kDa y por mostrar elevada afinidad por membranas que contienen esfingomielina. Estas toxinas son de interés biotecnológico por su potencial para ser utilizadas en el diseño de nuevos fármacos contra enfermedades parasitarias, como componente de sistemas liposómicos de liberación de antígenos al citosol célular en vacunas o para terapias contra el cáncer. Recientemente nuestro grupo reportó una actinoporina obtenida de una anémona de la costa Pacífico costarricense. Dicha toxina fue caracterizada a nivel molecular y funcional y se le dio el nombre de nigrelisina (Ng). En dicha caracterización se determinó que esta nueva molécula es tan potente en su acción como sticolisina II (StII; la actinoporina más potente que se conoce, la cual se obtuvo de una anémona del mar Caribe). Recientemente hemos detectado que A. nigrescens produce al menos dos isoformas más de la molécula, con características peculiares como lo es la incorporación de un residuo de prolina en la posición 2 de su terminal amino y variación en la secuencia de otros residuos en posiciones claves para la acción de estas toxinas. Esta propuesta tiene como objetivo conseguir los fondos para realizar la caracterización de dichas isoformas y poder comparar su actividad respecto a Ng y StII. La caracterización de estas dos isoformas contribuiría desde una perspectiva científica,a una mayor comprensión de la relación estructura-función de estas proteínas. A su vez, este conocimiento sumado al de otras investigaciones, podría favorecer el diseño racional de nuevos fármacos.