研究方向

實驗室研究主題：腸病毒 71 型及日本腦炎病毒之病毒複製和宿主之間的相互作用機制。

我們實驗室主要從事高深的病毒與寄主互相作用的研究。目前實驗室執行國科會計畫有兩大方向：

(一) 分析 RNA 病毒感染細胞後誘發外分泌蛋白質以及探討其可能的功能：

日本腦炎病毒（JEV）屬於黃熱病毒科（Flaviviridae）中的黃熱病毒屬（Flavivirus），需要以蚊子作為傳播媒介，人類受到感染時可能會產生嚴重的病毒性腦炎。目前已知宿主細胞受到病毒感染時會有部份宿主蛋白被誘發而大量產生以及分泌發炎性的細胞素（cytokines），有許多證據指出病毒顆粒會與宿主蛋白結合或是宿主蛋白會包含在病毒顆粒當中，而這些蛋白質可能提供病毒逃過宿主免疫系統防禦的方法或是進入宿主細胞及由宿主細胞釋放出去的機制。到目前為止，全世界尚未有研究報導分析並且利用蛋白質體學的分法檢測有哪些受到日本腦炎病毒感染後誘導出來的細胞外泌蛋白（secreted proteins）。而本研究計畫初步已經建立將幼倉鼠腎臟細胞（BHK-21）培養於較低濃度血清之培養液環境下，再以日本腦炎病毒感染後，將細胞培養於不含血清的培養基一段時間後，收集培養基，藉由液相層析儀-質譜儀（LC-MS）分析不含血清之培養液中幼倉鼠腎臟細胞的外泌蛋白，初步研究結果顯示共偵測到五種宿主細胞的外泌蛋白，其中包含分子伴隨蛋白（molecular chaperones）Hsp90, Hsp70及GRP78。進一步利用分子病毒學方法研究 GRP78於日本腦炎病毒生活史中可能扮演的角色，發現 GRP78 可以促進日本腦炎病毒新合成病毒顆粒的感染力，這項結果已經發表於國際病毒學期刊。本研究計畫將延續上述實驗結果，利用已經建立的方法，以蛋白質體學方式系統性地檢測、並且鑑定受到日本腦炎病毒感染後所分泌到胞外的宿主蛋白。接著我們將研究已經鑑定出的日本腦炎病毒誘導外分泌的蛋白，例如Hsp70及Hsp90，在日本腦炎病毒生命週期中所扮演的角色。總之，系統性的辨識及分析由受日本腦炎病毒感染細胞後所誘導的外分泌蛋白之功能可能幫助我們瞭解這些蛋白質於宿主細胞與日本腦炎病毒致病機制之間的關係。

(二) 宿主 RNA 結合蛋白於日本腦炎病毒複製的角色：

日本腦炎病毒（Japanese encephalitis virus; 縮寫：JEV）於宿主內複製的時候，需要依賴於宿主RNA結合蛋白執行許多功能。文獻指出有一些宿主RNA結合蛋白會參與使用病毒RNA的需求，完成其複製 RNA的目的。另外一群RNA結合蛋白在受到病毒感染的細胞中會被利用，作為促進胞膜結合的複製酶複合物的裝配與調節複製酶的活性。此外，宿主RNA結合蛋白也會影響病毒RNA基因組的穩定性，避免新合成的病毒RNA進入細胞RNA的解途徑。事實上，許多宿主RNA結合蛋白可在細胞受到病毒感染後表現出特殊的功能，其他的也會在病毒感染過程中參與的不同的角色。幾個序列保守的宿主RNA結合蛋白，如eEF1A和hnRNP 核蛋白的蛋白質家族，同時被報導在不同RNA病毒感染細胞中有其共同的功能，都是被病毒利用來促進其複製的能力。相反的，一些RNA病毒則選擇比較獨特的宿主RNA結合蛋白，幫助其完整的感染週期；這些事項證明不同RNA病毒可以利用不同的宿主RNA結合蛋白，以執行其所需的功能。總體而言，我們假設日本腦炎病毒必須利用宿主RNA結合蛋白適應獨特的複製策略。更深入的了解病毒是如何利用宿主RNA結合蛋白幫助其複製功能，將使我們能夠開發新的抗病毒策略，並且在RNA生物學上提供新的見解。我們提出以下目標：(1) 找尋更多日本腦炎病毒利用的宿主RNA結合蛋白以及幫助其複製能力。(2) 探討宿主RNA結合蛋白在於穩定病毒RNA 及控制宿主mRNA的作用機制。(3) 嘗試找尋與日本腦炎病毒和宿主RNA結合蛋白相互作用的調控機制及其在生理/病毒上扮演的意義。

過去研究的主題：

(一) 嘗試將兩種正股 RNA 病毒 (腸病毒 71 型 Enterovirus 71，EV71及日本腦炎, Japanese Encephalitis Virus，JEV)，轉型進入酵母菌中，測試其是否可以利用酵母菌為宿主進行複製；進一步利用這種最簡單的真核生物，進行病毒與寄主蛋白的互動機制研究。這項研究策略是基於過去我在美國肯塔基大學病理學部門進行研究工作。我使用tombusvirus (一種感染於植物的 positive stranded RNA病毒)作為一個模型。加上以 Yeast 為宿主進行實驗，成功地證明 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenas(GAPDH)，一種著名的代謝酵素，能透過它的選擇性結合不同股 RNA 的能力提升RNA 病毒的複製。

這重要發現將領導病毒學家理解病毒能利用寄主細胞內原有的蛋白質,提供本身複製和演化的一項工具。這也提供研究對抗病毒及病毒傳染病作戰的一個新的策略及線索。我的這項研究工作也發表於 Cell Host&Microbe , 這是全世界最好的研究病毒及寄主互相作用雜誌之一。

(二) 利用蛋白質體學方法，分析受到腸病毒 71 型及日本腦炎病毒感染後細胞之外分泌蛋白的組成，並且探討其可能影響病毒於體內複製，體外感染的機制。我的主要研究方向如下：

1. 利用系統生物學的方式，包括基因組及蛋白質體的篩選方式，尋找可能參與/影響 RNA 病毒複製的宿主蛋白。

進而研究這些蛋白對於病毒複製的角色與實際參與的功能。

2 分析及功能性闡述三種 RNA 結合性宿主蛋白於 RNA 病毒複製過程中參與的角色。包括：Glyceraldehyde-3-

phosphate dehydrogenase (GAPDH), p68 DEAD-box RNA helicase homolog Dp2 以及蛋白轉譯延長因子

(EF-1 alpha)。

3. 負責液泡性蛋白分煉之功能性蛋白對於 RNA 病毒複製的角色。