Il Regio Liceo a Livorno fu istituito con legge 10 marzo 1860 dal ministro per la Pubblica Istruzione Terenzio Mamiani: sino al primo preside eletto prof. Luigi De Steffani, in  carica dal 1862 al 1867, tale funzione fu svolta dal padre Barnabita Giuseppe Ferrero, già preside del Regio ed Imperiale Liceo fondato nel 1855 dal Granduca di Toscana.

Il liceo fu intitolato a Giovan Battista Niccolini (1782-1861), amico del Foscolo che gli dedicò la traduzione della Chioma di Berenice, nel 1862, un anno dopo la sua morte.

Nell'attuale sede, via Ernesto Rossi 6, ex ospedale israelitico, il Liceo vi giunse nel 1862.

Nel 1883 il Ginnasio fu intitolato a Francesco Domenico Guerrazzi (1884-1873), romanziere e parlamentare italiano.

L'intitolazione doppia Niccolini-Guerrazzi entrò in vigore nel 1889 ed è rimasta tale fino all'accorpamento con il Magistrale Palli nell'attuale ISIS Niccolini Palli.

Primo insegnante di lettere fu Ottaviano Targioni Tozzetti (1833-1899), poi preside dal 1884 al 1897. Giovanni Pascoli (1855-1912) vi insegnò Greco e Latino dal 1887 al 1895.

Altro autorevole docente è Carlo Azeglio Ciampi, ex presidente della Repubblica, che vi insegnò lettere nel 1945. Nel secondo dopoguerra si annoverano: Carlo di Spigno, Giovanni Buti, Elio Rossi, don Renato Roberti, Francesco De Luca, Enrica Giordanengo.

Fra gli allievi più noti Pietro Mascagni (1863-1945) che vi seguì il ginnasio negli anni 1875-76, l'imprenditore chimico che lanciò la Montecatini, Guido Donegani (1877-1947) che vi si diplomò nel 1893, Guglielmo Marconi che lo frequentò nel 1891 come allievo personale del prof. De Rosa, Amedeo Modigliani (1884-1920), che vi frequentò la V ginnasio nel 1897-98, Giosuè Borsi (1888-1915) che si diplomò nel 1905.