Q.　筑波大学外の研究機関、民間企業等でも利用できますか？

A.　利用できます。受付窓口によって解析料は「学内解析料」よりはやや高くなりますが、アカデミック研究機関との共同研究、実験デザインのコンサルティングや追加のデータ解析を含む場合など、いろいろなケースが考えられますので、ご相談ください。

Q.　筑波大学との共同研究として扱う必要がありますか？

A.　臨床検体解析や宇宙生命科学分野など、詳しいデータ解析や結果の解釈に参加する共同研究のプロジェクトも多いですが、標準的な納品パッケージのご利用では必要ありません。共著者に筑波大学の研究者が含まれない、i-Labサービスを活用した論文も多数発表されており、普通の受託サービスと同様です。Methodや謝辞のところに「Tsukuba i-Laboratory」を記述していただけると実績として残るため助かりますが、特に決まりはありません。

Q.　研究計画の審査などはありますか？

A.　ありません。技術的、倫理的に解析できないご依頼は、お問い合わせや検体依頼書をメール送信していただいた段階で判断しています。

Q.　見積り作成はできますか？

A.　できます。見積書の宛名、解析内容をメールでご連絡ください。PDF版で作成させていただきますが、印刷版での対応も可能です。

Q.　解析がうまくいかなかった場合は解析料は発生しますか？

A.　QC結果を見ながら作業を進めますので、RNAseqであれば、RNA量や品質の段階で解析の可否を判断します。「RNA精製・QCのみ」は学内解析料で1000円のため、検体を再送付しない場合は、1検体につき1,000円を請求することもあります。（失敗することはめったにないので、現実的には、その都度ご相談になります。）RNAseqの場合、ライブラリ作製以降で期待通りデータが出ない場合は請求無しになります（これも稀にしかありません）。

Q.　「ゲノム支援」のトランスクリプトーム解析と同様のサービスを受けることは可能ですか？

A.　コスト負担はありますが、応募・審査のサイクル無しに随時ご依頼いただけます。解析サービスでは使用キットの指定などは対応が難しいですが、特殊な要求がある解析プロジェクトはゲノム生物学グループの共同研究としてご協力できます。

Q. RNA精製は自分で行ったほうが良いですか？

A. TRIZOL検体で送っていただいて、RNA精製はi-Lab（まほろロボット）で行うのがお薦めです。微量検体でも収量が良く、RNA分解酵素のコンタミネーションの心配もないため、その後のQC作業やライブラリ作製も安定して行えます。RNA精製後のQC（濃度、RIN値の測定など）もRNAseqサービスに含まれています。

Q. 附属病院のバイオバンク検体の解析を依頼することはできますか？

A. これまでに、RNAseq、がん遺伝子パネル解析などに対応しています。つくばヒト組織バイオバンクセンターで審査・分譲手続きが完了している検体は、直接転送することができますので、バイオバンクの担当者にお知らせください。-80℃保管試料も十分に温度管理に注意して転送・保管することが可能となり、解析にも有利です。DNA抽出サービスから直接DNA検体を転送依頼いただくこともできます。

Q. 「まほろ」ロボットは、実際どのくらいの作業を担当していますか？

A. RNA-seqでは、「TRIZOL検体からトータルRNA」、NEBキットを用いた「トータルRNAからrRNA除去済みまたはPoly-A精製済み RNA」、「rRNA除去済み・poly-A RNAから精製済みライブラリ」までの3つのセクションを人手の介入なしに自動で行っています。RNA断片化やその他の条件で調整が必要で、検体数がまほろの作業フローに合わない場合などは、手作業でも行います。その他、年度末の繁忙期にも、手作業で行う場合があります。RNAおよびライブラリのQC、分注作業などは今のところ手作業で行っています。

Q. なぜRNA精製カラムではなくTRIZOLを推奨しているのですか？

A. TRIZOL（ISOGEN、セパゾールなども、同等なものとして扱っています）には次のような長所があると考えています。

・TRIZOLに溶解された細胞や組織では、凍結融解を繰り返してもRNAが安定で、「予備」として、一部の検体を残しておける。

・RNAのサイズ選択性がカラムよりは低く、small-RNAも同じ精製RNAを用いて解析できる。（small-RNAの修飾やGC含有率によってTRIZOLにも選択性があるとの報告はあります。）

・カラムへの吸着・残留によるRNAロスが少なく、特に微量検体を扱う場合に有利。

・RNAがペレットになって回収・再懸濁できるため、溶出ボリュームを微量に抑えることができ、低濃度のRNAをライブラリ作製に効率的に持ち込める。

Q. RNAをDNase処理していませんが、大丈夫ですか？

A. 通常、精製されたRNAにはゲノムDNAが少し混ざり、RNAseqのバックグラウンドになる可能性があります。i-Labの大部分のRNAseqで使用しているrRNA-depletionでは、RNaseH処理の後にDNase処理があり、コンタミしているDNAはそこでプローブとともに分解されます。また、Poly-A RNA精製では、mRNAをビーズで精製・洗浄するため、DNAやpoly-A RNA以外は取り除かれます。Low-input RNAのプロトコル（TARARA SMARTerキット）では、遺伝子外領域のリードについて、DNAのコンタミの可能性をデータ解析時に、より慎重に評価する必要があります。

Q. FFPE検体のRNAseq解析はできますか？

解析を予定しているFFPE検体と同じラボで処理された少数の検体を用いて一度解析をご依頼いただければ、品質の確認を兼ねて解析を行えます。RIN値が２-3程度あるものは、少なくとも定量目的のRNAseq解析ではうまくいく例が多いです。解析できない検体では「１」に近いRIN値が出ます。

Q. なぜrRNA除去によるRNAseqライブラリ作製を推奨しているのですか？

A. データの統合解析には、できるだけ多くの解析でプロトコルを揃えたほうが有利なため、様々なRNA品質の検体に対応できるrRNA-depletionに方法をお薦めしています。rRNA-depletionでは高品質のRNAから分解が進んだFFPE検体由来のRNAまで対応でき、インプットRNAの量でも、5ng程度からフルスケールの500ngまで、同じキットを用いた解析が提供できています。さらに、mRNA以外のRNAが読めるのもrRNA-depletionの利点です。転写中のpre-mRNAなどは、イントロンのリードとして見ることができ、細胞内に蓄積されているRNA量（steady-state level）と区別して、転写の活性化状態を推定することもできるため、遺伝子発現制御について多様な解析にも役立ちます。ヒト・マウス・ラット以外の生物種でも同じrRNA-depletionキットでの解析を希望される場合もあり、特にゲノムサイズの小さい生物種では良いデータが出ています。一方で、スプライシングバリアント、エキソン部分のSNP、体細胞変異、融合遺伝子などを解析する場合は、エキソン部分に効率よくリードが集まるpoly-A精製をお薦めしています。

Q. Stranded (RNAの方向性が保たれている）RNAseqデータを得ることは可能ですか？

A. rRNA-depletion、Poly-A精製、および、Low-inputライブラリの全てでStrandedライブラリキットを使用しています。イルミナ純正のStrandedライブラリとは逆方向に元のRNA配列が現れますので、データ解析の際は「Documentation」の「解析フロー」にある各キットのマニュアルを参照してください。

Q. なぜ解析に市販ソフトを使用しているのですか？

A. 産学連携の解析プラットフォームということで、企業・大学どちらでも同じ解析パイプラインを維持できるように、高度なバイオインフォマティクスの手技に依存しない運営方法をデータ解析にも取り入れるためです。また、メンテナンスの行き届いた商業ソフトウェアを導入することで、一定の品質を保証できたり、自動的に操作ログが各ファイルに残る利点もあります。

Q. CLC Main Workbenchのライセンスはどこで購入できますか？

A. キアゲンウェブサイトで30日間のトライアルがあるようです。キアゲン製品を扱っている業者にお問合せいただければ購入できます。i-Labでも解析オーダー時に登録情報をご記入いただければ、結果報告に合わせてライセンス発行できます。トライアル版のインストールで「Virtual machineにはインストールでできません」というエラーが出る事例がありました。キアゲンのCLCサポートに連絡すると解決してもらえます。

Q. RNAseqの解析に使っている遺伝子データベースは何ですか？

A. CLC Genomics WorkbenchではEnsembleの遺伝子アノテーションに基づいたアノテーションをCLCのサーバーからダウンロードできるようになっています。しかし、このデータベースは短い間隔でどんどんアップデートされ、遺伝子数もその都度変化する（増える）ため、マウス（㎜10）では2016年12月、ヒト（hg19）では2017年1月にダウンロードされた遺伝子とトランスクリプトモデルをこれままでずっと使い続けています。CLCファイルが必要な場合はお問い合わせください。また、Excel形式でExportしたファイルは「Documentation」に置いてあります。細かいところで修正が入っており、CLC独自のデータベースのようですが、特に複数Transcriptやオーバーラップした遺伝子などの処理は便利なように工夫されている印象です。このことで、遺伝子の名前が標準的なものと異なる場合が稀にありますが、ゲノム上のCoordinateから再確認すると、make senseな対応がなされている印象です。

Q. インフォマティクスは初心者です。解析はどうすればよいですか？

A. 統計解析まで行ってから納品していますので、発現量を比較するところまではExcelファイルを見ていただければ大丈夫です。大学院のバイオインフォマティクス実習で用いているテキストがDocumentationにあります。Excelとウェブブラウザがあればいろいろなことができますので、最初の部分だけでもトライしていただければと思います。

Q. 解析にお薦めのコンピューターはありますか、生データから解析したいので購入を検討しています。

A. お問い合わせいただければ、ゲノム生物学研究室で使用しているワークステーションの情報をお送りできます。

Q. RやPythonの知識は必要ですか？

A. 解析や可視化にはLinux、R、Pythonで利用できるツールが多数ありますが、似たような機能のウェブツールもあります。まずはGalaxy、Google検索で見つかるウェブベースの手法から始められます。いくつかの例については、解析テキストをご覧ください。大学院の実習でも導入部分をカバーしています。

Q. 変異のアノテーション付けサービスは提供していますか？

A. キアゲンのQIAseqパネル解析では、CLC Genomics Workbenchのワークフローで解析を行い、QCIレポート作成へ再委託が可能です。解析費用はシークエンシング分と一緒に請求できますが、一定数は学内解析用の枠があり、追加費用無しでご利用いただけます。Exomeでは変異候補箇所はリストアップされますが、フィルタリングやアノテーションン付けはユーザーの共同研究者の方にお願いしていただいています。調べたい遺伝子があらかじめ分かっている場合には、i-Lab納品ファイル内で遺伝子名の検索を行うことで、変異候補を絞り込むことはできます。

Q. RNAseqによる融合遺伝子解析はできますか？

A. キアゲンのCLC Genomics Workbenchのワークフローで解析を行っています。単一の検体を用いた解析ではFalse callが多く、新規融合遺伝子の発見はほとんど期待できません。しかし、融合遺伝子の片方が予測できる場合は、もう一方の遺伝子が見つかる場合が多いです。疾患名やFISH解析の結果から、予測がつくような場合にご依頼ください。

Q. データベースアップロードのサービスはありますか？

A. 短期的に対応できそうな課題として検討しており、サービス提供は可能と思います。また、実験条件なども含め、公共データベースへアップリンクできるか、など、実験シェアや共同研究プラットフォームの方向でも、広く可能性を模索中です。NASA GeneLabなど、宇宙生命科学関連のデータベースアップロードはサポートできます。

Q. DDBJへFASTQファイルをアップロードしたいのですが、メタデータはどのように入力すればよいですか？

A. 「Documentation」にRNA-seqの例でテンプレートのエクセルファイルがあります。各ステップに対応したタブが含まれていますので、順に参照していただけます。

Q. 返送に料金はかかりますか？

A. 保冷剤や送料など、実費を請求になります。解析料には含まれていませんが、「検体輸送費」などの項目で追加できます。