Las esporas asexuales formados por HMAs tienen las características morfológicas necesarias para la identificación morfológica a nivel de especie. Las esporas son uno de los principales propágulos por lo general cuantificados en los estudios ecológicos, a pesar de que no representan al individuo fúngico, su cuantificación se ha utilizado como una medida del potencial reproductivo de HMAs. Abajo se presentan los métodos utilizados habitualmente en el CICG para manipular las esporas.
La extracción de esporas de HMAs es una de las actividades de rutina en el CICG. El método utilizado para extraer las esporas de cultivos puros, cultivos trampa o de muestras de suelo del campo es el tamizado en húmedo (Gerdemann & Nicolson, 1968) seguido de centrifugación en gradiente de sacarosa (20% y 60%).
La muestra de suelo será diferente de acuerdo con su origen: a) una pequeña porción (ca. 30 ml) del substrato se retira de uno de los lados con la ayuda de tijeras para analizar cultivos puros, b) uno o dos cilindros de metal (ca. 50 ml) se retiran de las macetas para analizar cultivos trampas, y c) alícuota del suelo (50 o 100 ml) de las muestras provenientes del campo que se envían para ser depositadas en el CICG. Es importante en todos los casos que las muestras incluyan raíces dado que algunas especies de HMAs producen esporas intraradicales.
La muestra se coloca en una licuadora comercial con capacidad de 2 l, se suspende en agua de la canilla (aprox. 1,7 l). Se activan dos pulsos rápidos en la licuadora para poner las esporas en suspensión. La suspensión se pasa a través de dos tamices superpuestos, teniendo cuidado de que la mayor parte de las partículas del suelo quede retenida en vaso de la licuadora.
Si no tienes una licuadora - La muestra se coloca en un balde de plástico con capacidad de 2 l, se suspende en agua de la canilla (aprox. 1,7 l) y se agita vigorosamente con una varilla de vidrio. Después se pasa la suspensión a través de dos tamices superpuestos, teniendo cuidado de que la mayor parte de las partículas del suelo quede retenida en el balde de plástico
El tamiz de abajo tiene una abertura de malla de 45 µm, donde la mayoría de las esporas serán retenidas. También se pueden utilizar otros tamices con aberturas de 53 µm, 38 µm e 25 µm .
El tamiz superior tiene una abertura de malla de 710 µm. En este tamiz se conservarán raíces de mayor tamaño, restos orgánicos y partículas más grandes de suelo (arena) y esporas grandes y esporocarpos.
En algunos casos, cuando se sospecha que hay esporas de diversos tamaños presentes en la muestra de suelo, se puede colocar un tercer tamiz de 180 µm entre los tamices de 45 y 710 µm.
El material retenido en el tamiz de 710 µm es transferido a una placa de Petri grande e inspeccionado bajo la lupa para observar y recoger esporas grandes y esporocarpos. El material retenido en el tamiz de 45 µm se recoge en un vaso de precipitados con la ayuda de una "goma de policía" pegada a una varilla de vidrio y después se transfiere a tubos Falcon de 50 ml que contienen un gradiente de 20% a 60% de sacarosa (15ml de cada solución). Luego los tubos se centrifugan durante 1 minuto a 2000 rpm (centrífuga marca CCC). En este proceso, el suelo y otras partículas sedimentan y las esporas y partículas orgánicas finas quedan suspendidas en la sacarosa
El sobrenadante de cada tubo se decanta rápidamente sobre un tamiz de 45 µm de acero inox. Este tamiz tiene la misma abertura de malla que el tamiz utilizado en el tamizado en húmedo, pero tiene un tamaño menor. El material recogido en este tamiz se lava durante 1 minuto con agua de la canilla para eliminar el exceso de sacarosa y se transfiere a placas de Petri. Las esporas se observan en la lupa y se recogen manualmente con una pipeta Pasteur con la punta afinada en el fuego. Las placas y las esporas recogidas se almacenaron en un refrigerador (4º C) y se procesan de acuerdo con la finalidad en el plazo de una semana..
Para avanzar el trabajo en la colección de esporas, inicialmente se hace una medición en la lupa del tamaño de las esporas de diferentes morfotipos (en el caso de las esporas provenientes de cultivos trampa o de campo). Después, el material recogido en el tamiz de 45 µm (mayor de 45 µm y menor de 710 µm) se puede hacer pasar a través de varios tamices con diferentes aberturas de malla (300, 250, 180, 125 y 90 µm.) Este proceso facilita la colecta de esporas, ya que no hay separación de morfotipos de diferentes tamaños y también separa los detritos de diferente tamaño
El paso final y más laborioso es separar las esporas de cada morfotipo (excepto en caso de cultivos puros) para ser utilizado con diversos fines (montar esporas en portaobjetos, inocular plantas para experimentos o para cultivos puros, extraer ADN, experimentos de germinación, etc). Para separar las esporas en morfotipos, es necesario conocimiento y habilidad en taxonomía, pero si las esporas están en buenas condiciones, cualquier persona que sea buen observadora puede separar las esporas en morfotipos.
Las esporas de HMAs provenientes de cultivos puros, cultivos trampa o suelo de campo se montan en láminas (portaobjetos) permanentes. Los medios de montaje utilizados son Polivinil-Lacto-Glicerol (PVLG) y PVLG mezclado con el reactivo de Melzer..
Sobre un portaobjetos, coloque suavemente una gota de PVLG y otra gota PVLG + Melzer. Después coloque las esporas utilizando una pipeta Pasteur con la punta afinada, con cuidado de no dispensar mucha agua junto con las esporas. Con una aguja, mezclar bien las esporas junto con los medios de montaje dejándolas en el centro de la gota. Después, deje la lámina (portaobjeto) descansar durante 5 minutos hasta que la superficie de la gota se seque (esto ayudará a que no salgan burbujas cuando se coloque el cubreobjeto)
Coloque un cubreobjetos delicadamente sobre la gota con PVLG y presione suavemente. Coloque otro cubreobjetos sobre la gota con PVLG+Melzer y presione suavemente.
Bajo la lupa quiebre las esporas individualmente utilizando una aguja o la punta de un lápiz, presionando directamente sobre el cubreobjetos. Con este procedimiento, cada espora se puede romper para obtener la forma de una C (o como el "pac man"), exponiendo de este modo las paredes germinativas. Si fuera necesario, añadir un poco más de medio de montaje por los lados del cubreobjeto. Deje secar el preparado a temperatura ambiente durante 5 días y después colóquelo en estufa a 35-40 º C durante 3 días para endurecer los medios de montaje. No hay necesidad de sellar los preparados porque con el medio de montaje endurecido se vuelven permanentes.
Una etiqueta siempre debe acompañar a cada portaobjetos y debe contener la siguiente información: a) nombre de género y epíteto específico si se conoce, b) fecha, c) código de cultura (o muestra).
Los portaobjetos están almacenadas en bandejas de aluminio en cajas de roble y organizadas por géneros y especies.
Las esporas de cada aislamiento en cultivo puro en el acceso CICG se conservan en eppendorfs que contienen azida de sodio. Las esporas se extraen de los cultivos y se recogen manualmente con una pipeta Pasteur en el momento que el cultivo es examinado. Si un cultivo contiene una mezcla de especies (es decir, el cultivo no está puro), las esporas de cada morfotipo se recogen y se almacena en un eppendorf. Cada eppendorf contará con 100-150 esporas almacenadas en 0,05% de azida de sodio. Los eppendorfs se codifican con adhesivos de colores colocados en la tapa y se numeran secuencialmente en el orden en que han sido procesados. En cada eppendorf se adjunta una etiqueta que contenga la siguiente información: nombre de la especie o el género, código de CICG y fecha (en que las esporas han sido almacenadas). Los eppendorfs se almacenan en soportes a 4 ° C.
Referências
Gerdemann JW, Nicolson TH (1963) Spores of mycorrhizal Endogone species extracted from soil by wet sieving and decanting. Transactions of the British Mycological Society46:235-244.