O objetivo desta aula é analisar a concentração da amilase circulante, enzima que está diretamente relacionada às secreções pancreáticas. A amilase é uma hidrolase normalmente secretada pelas células acinares do pâncreas para o ducto pancreático e, deste, para o duodeno. No intestino, a amilase hidrolisa os carboidratos em seus componentes, os açúcares. Quando ocorre uma lesão nas células acinares, como na pancreatite, ou quando há uma obstrução no fluxo do ducto pancreático, como no carcinoma pancreático, a amilase fluirá para o sistema linfático intrapancreático e peritônio e, por drenagem, atingirá os vasos sanguíneos em concentração elevada.
A amilase hidrolisa o amido, liberando moléculas de açúcares e dextrina. Após a adição da solução de iodo, ocorre a formação da cor azul com o amido não hidrolisado do substrato. Nessa técnica, a atividade da amilase é inversamente proporcional à intensidade da cor azul formada e é calculada em comparação a um controle de substrato. A amilase alcança um aumento anormal dentro de 12 a 24 horas após o início da doença, sendo rapidamente clareada pelos rins. Ela atinge os níveis normais em 48 a 72 horas. Nos casos de pancreatite persistente, obstrução dos ductos pancreáticos e pseudocisto pancreático, os níveis de amilase no soro estarão persistentemente aumentados.
Amostra biológica fresca ou centrifugada;
Luvas;
Tubo a vácuo;
Centrífuga;
Ependorf;
Micropipetas 10μL, 500μL e 1000μL;
Kit amilase cinético-colorimétrico;
Béquer 25mL;
Estante de micropipetas;
Ponteira para micropipetas;
Banho-maria a 37º C;
Cronômetro;
Aparelho espectrofotômetro;
Descarte com parede rígida;
Equipamentos de Proteção Individual (EPIs): avental, máscara e luvas descartáveis.
Substrato;
Iodo-estoque.
Soro e plasma com heparina;
A enzima é estável por 30 dias, quando conservada em uma temperatura entre 2 e 8º C.
Incubar por 2 minutos a 37° C 1 tubo (controle) e 1 tubo (teste) com 500 µL de substrato;
Adicionar somente no tubo “teste” 10 μl da amostra biológica. Homogeneizar e incubar a 37° C por exatamente 7 minutos e 30 segundos. Cronometrar;
Em seguida, proceder:
Homogeneizar e esperar 5 minutos.
Fazer as leituras fotométricas do teste e controle em 660 nm ou filtro vermelho (620 a 700), acertando o zero com água deionizada. A cor é estável por 30 minutos.
AC = Absorbância do controle
AT = Absorbância do teste
AMILASE/dL = AC – AT X 800
AC
1)
PACIENTE 1 🡪 AC – AT/AC X 800= (0,456 - 0,390) / 0,456 x 800 = 115,78 dL
PACIENTE 2 🡪 AC – AT/AC X 800 = (0,455 - 0,385) / 0,455 x 800 = 123,07 dL
PACIENTE 3 AC – AT/AC X 800 = (0,477 - 0,401) / 0,477 x 800 = 127,46 dL
Sendo assim:
Todos os pacientes estão normais.
A vantagem do método cinético em relação ao ponto final é que o método cinético faz múltiplas leituras ao decorrer da análise, o que possibilita minimizar os interferentes na amostra. O teste se torna, portanto, mais confiável.
A metodologia cinética de tempo fixo é simples e rápida para a dosagem da amilase nos diversos tipos de líquidos biológicos.
O substrato utilizado contém um conservante potente para impedir a contaminação bacteriana ou fúngica. Além disso, propicia excelentes condições para a ação da atividade da enzima. A metodologia permite obter resultados precisos e exatos, se for executada assim como é descrito na Instrução de Uso.