Reação de Floculação

Prof. Esp. Juliana Cogo

Introdução

Determinação qualitativa e semiquantitativa de anticorpos não treponêmicos para o diagnóstico de sífilis

A sífilis é uma doença infecciosa humana causada pela bactéria espiroqueta, Treponema pallidum. Ela é, primeiramente, uma doença transmitida sexualmente, no entanto pode ser transmitida por outras vias, como a transfusão de sangue infectado (hoje, praticamente, eliminada por meio de triagem sorológica de rotina), e a perinatal (sífilis congênita) é transmitida pelos treponemas procedentes da mãe infectada para o feto em desenvolvimento.

Clinicamente, após um período de incubação, que varia de dez a 90 dias, ocorre o surgimento de um cancro duro, que é uma lesão solitária e indolor, caracterizando a sífilis primária. Após um período de quatro a dez semanas, depois do aparecimento do cancro, surgem, frequentemente, sintomas, como perda de peso, cefaléia, anorexia, mialgia, artralgia, mal-estar, febre baixa, linfadenopatia generalizada e exantema (presente em 75 a 100% dos casos), o que caracteriza a sífilis secundária. Podem ocorrer também nesse estágio manifestações de comprometimento do sistema nervoso central.

Após as manifestações primárias ou secundárias, ocorre o período conhecido como sífilis latente, caracterizado por testes sorológicos positivos e ausência de achados clínicos. Pode ter duração de um a dois anos. Sem tratamento, cerca de um terço dos pacientes apresenta sífilis terciária, que pode manifestar-se como goma (15%), sífilis cardiovascular (10%) ou neurossífilis (8 a 10%). O diagnóstico da sífilis pode ser realizado por uma ampla variedade de reações sorológicas, classificadas em: testes não treponêmicos e treponêmicos.

Testes não treponêmicos

Os pacientes infectados com T. pallidum produzem altos níveis de anticorpos que reagem com a cardiolipina, denominados anticorpos anti-cardiolipina, ou anticorpos de Wassermann. Os testes que empregam os antígenos cardiolipínicos, embora apresentem especificidade limitada, têm alta sensibilidade, baixo custo, são de fácil execução e apresentam pronta resposta ao tratamento.

VDRL (Veneral Disease Research Laboratory), teste de floculação realizado em placas escavadas, com diluições do soro do paciente.
RPR (Rapid Plasma Reagin).

Os anticorpos detectados nos testes não treponêmicos (IgM e IgG) aparecem entre uma e quatro semanas após o aparecimento do cancro. Os testes não treponêmicos são usados mais comumente para a triagem, devido à sua alta sensibilidade, e, também, para o acompanhamento do tratamento e critério de cura. Os níveis dos anticorpos anti-cardiolipina no soro de pacientes com sífilis tendem a se correlacionar, diretamente, com a intensidade da doença, elevando-se com o dano tecidual e diminuindo quando este declina. Dessa maneira, refletem a atividade da doença e, também, a eficácia do tratamento (níveis declinam).

Os antígenos à base de cardiolipina, embora tenham aumentado a sensibilidade e a especificidade, não eliminaram as reações inespecíficas ou falso-positivas, sendo assim, há somente uma evidência presuntiva no diagnóstico da sífilis, devendo, portanto, serem confirmados pelos testes treponêmicos.

Testes treponêmicos

Detectam anticorpos dirigidos para antígenos treponêmicos. São utilizados como antígenos, treponemas íntegros (Treponema pallidum) ou seus extratos. A necessidade de se realizar um teste treponêmico está relacionada ao resultado do teste não treponêmico. Testes treponêmicos deveriam ser realizados quando os sinais clínicos ou a história do paciente não são compatíveis com o resultado reagente do teste não treponêmico. Em geral, somente quando se suspeita de sífilis tardia deve-se realizar o teste treponêmico mesmo quando o teste não treponêmico for não reagente

Os testes treponêmicos, usados como testes confirmatórios para os soros reativos nos testes de triagem, são:

TPHA (Treponema pallidum Hemagglutination): reação de hemaglutinação indireta
FTA-Abs (Fluorescent Treponemal Antibody Absorption)
Reações imuno enzimáticas: quimioluminescência e Elisa.
Testes imunocromatográficos.

Pela longa permanência de anticorpos anti-T. pallidum, após tratamento e cura bacteriológica da sífilis, os testes treponêmicos não devem ser utilizados para seguimento terapêutico. Na técnica de VDRL, o antígeno é uma suspensão de cardiolipina adsorvida a cristais de lecitina e de colesterol. Quando a suspensão antigênica é misturada com soro, plasma ou líquido céfalo-raquidiano (LCR) que contenham anticorpos (reaginas), as partículas de antígeno floculam, e o resultado da reação é observado no microscópio. A ausência de floculação indica resultado negativo.

Materiais e
Equipamentos

Luvas.
Placa escavada de vidro (Placa de kline).
Kit de VDRL.
Controle positivo e controle negativo.
Pipetas e ponteiras.
Solução fisiológica (NaCl: 0,9%).
Cronômetro.
Microscópio óptico.
Agitador de placa.

POP

Amostras: soro, plasma ou líquido céfalo-raquidiano (LCR).

Nota: utilizar amostras de soro ou plasma fresco colhido com EDTA. As amostras de soro podem ser armazenadas por até 48h entre 2 e 8oC. As amostras podem ser congeladas a -20oC durante seis semanas. As amostras lipêmicas podem produzir resultados falsamente positivos por aglutinação inespecífica.

ATENÇÃO: para evitar o efeito de pró-zona, sugerimos que o teste qualitativo seja realizado com soro, plasma ou líquido céfalo-raquidiano (LCR) puro e diluído 1:8.

Procedimento:

Método qualitativo

Antes da realização do teste, deixar os reagentes e as amostras atingirem a temperatura ambiente.

Em duas áreas distintas da placa de reação, pipetar 50 μL de amostra pura ou de amostra diluída 1:8.

Em outras áreas, pipetar 50 μL dos controles positivo e negativo.

Homogeneizar o reagente VDRL com suavidade e pipetar 20 μL em cada área a ser analisada.

Utilizando o agitador de placa, agitar a placa a 180 r.p.m. durante quatro minutos. Imediatamente, após, verificar a presença, ou não, de floculação no microscópio com aumento de 60-100 x (condensador baixo), comparando o resultado da amostra com os padrões obtidos nos controles.

Leitura e interpretação

Examinar microscopicamente a presença, ou ausência, de aglutinação logo após os quatro minutos.

Figura 1 - Imagens representando uma reação de floculação não reagente em A e reação reagente em B.

Fonte: a autora.

Negativo: ausência de floculação.

A suspensão é homogênea semelhante ao padrão obtido com o controle negativo.

Positivo: presença de floculação.

Todo teste positivo deverá ser titulado utilizando o Método Semi-Quantitativo.

Método semi-quantitativo

Diluição da amostra – Diretamente na lâmina

Pipetar 50 μL de solução salina em cinco cavidades da placa.

Em seguida, adicionar a primeira cavidade 50 μL da amostra que apresentou teste qualitativo positivo e fazer a homogeneização adequadamente, utilizando a mesma pipeta e ponteira. Para isso, aspire e devolva, cuidadosamente, a solução para o mesmo círculo da lâmina.

Em seguida, transferir 50 µL dessa mistura para o próximo círculo. Repetir a homogeneização e transferir 50 µL para a próxima cavidade. Repita o procedimento até a última cavidade, desprezando 50 µL em recipiente de descarte. As diluições obtidas são 1/2, 1/4, 1/8, 1/16 e 1/32, respectivamente.

Diluição de amostra – Em tubo

Tomar cinco tubos 12 x 75 e pipetar 0,1 mL de NaCI a 0,9% em cada tubo.

Adicionar ao primeiro tubo 0,1 mL da amostra que apresentou teste qualitativo positivo. Misturar, transferir 0,1 mL do primeiro tubo para o segundo tubo, misturar, transferir 0,1 mL do segundo tubo para o terceiro tubo e assim sucessivamente, até o quinto tubo. As diluições obtidas são 1/2, 1/4, 1/8, 1/16 e 1/32, respectivamente.

Tabela 1 - Tabela modelo para a realização da diluição seriada de amostras biológicas

Fonte: a autora.

- Nas áreas da placa, pipetar 50 μL de cada diluição da amostra.

Figura 2 - Imagem representando o processo de diluição de amostra em lâmina escavada em A e diluição de amostras em tubo em B.

Fonte: Brasil ([s. d.], p. 20).

Adição do reagente

Homogeneizar o Reagente com suavidade e pipetar 20 μL em cada área a ser analisada.

Agitar a placa a 180 r.p.m. durante quatro minutos. Imediatamente, após, verificar a presença, ou não, de floculação no microscópio com aumento de 60-100x (condensador baixo), comparando o resultado da amostra com os padrões obtidos nos controles.

Se ocorrer aglutinação até o tubo 1/64, continuar as diluições a partir do sexto tubo e realizar o teste.

Leitura da reação

Examinar, microscopicamente, a presença, ou ausência de aglutinação logo após os quatro minutos.

RESULTADOS

Prova semi-quantitativa: o título é dado pela última diluição observada que foi reativa.

Evitar liberar resultados usando a terminologia “positivo”, “negativo” ou, ainda, expressar o mesmo em cruzes.

- Negativos: reportar como “amostra analisada não reagente”.
- Positivos: reportar como “amostra analisada reagente até o título … (Indicar o título)”.

VALORES DE REFERÊNCIA:

Negativo (ausência de aglutinação)

Interpretação dos resultados

A pesquisa de anticorpos não treponêmicos torna-se positiva, geralmente, na segunda semana após o início do cancro. Pode ser considerada diagnóstico presuntivo de sífilis se for reativa em diluições > 1:16.
ATENÇÃO: Podem ocorrer reações falso-positivas em condições, como: imunizações, infecções, gravidez, malária, doenças autoimunes (lúpus eritematoso sistêmico etc.), doenças malignas etc. Títulos falso-positivos são, geralmente, menores que oito, mas títulos baixos, também, são observados na sífilis latente e tardia, e resultados falso-positivos com títulos altos são associados com o uso de drogas intravenosas e linfomas. As reações inespecíficas, raramente, são reativas em diluições superiores a 1:2.
Resultados falso-positivos de testes podem ser excluídos por meio de repetição do teste, confirmação com teste treponêmico e testagem subsequente de uma segunda amostra.
Quando é acompanhado em paciente com sífilis um aumento no título de quatro vezes em uma nova amostra, pode indicar uma infecção, uma reinfecção ou, ainda, falha no tratamento.
Um decréscimo do título de quatro vezes em sífilis recente indica terapia adequada.

Na Prática

Verifique seu Aprendizado

1) PNS, 21 anos, masculino, solteiro, estudante universitário, natural e procedente de Salvador, procurou Unidade de Pronto Atendimento após notar o aparecimento de uma lesão única no pênis, indolor e de bordas elevadas. O médico, ao suspeitar de sífilis, entrou em contato com seu laboratório de análises clínicas para discutir sobre os testes de diagnóstico para a sífilis (autoria própria). Você, como profissional habilitado(a), deverá auxiliá-lo.

Sobre a infeção e o diagnóstico de sífilis, CONSIDERE as seguintes assertivas a seguir:

I – A sífilis é uma infeção causada pela bactéria do tipo espiroqueta Treponema pallidum. Seu diagnóstico pode ser realizado pela pesquisa direta ou indireta. Nesse caso, deve-se optar pela pesquisa direta e cultura dessa bactéria.

PORQUE

II – Devido à fase de infecção apresentada pelo indivíduo, não houve tempo hábil para a produção e consequente detecção de anticorpos por meio dos métodos indiretos.

A respeito dessas asserções, ASSINALE a alternativa correta.

a) As asserções I e II são proposições verdadeiras, e a II é uma justificativa correta da I.

b) As asserções I e II são proposições verdadeiras, mas a II não é uma justificativa correta da I.

c) A asserção I é uma proposição verdadeira, e a asserção II é uma proposição falsa.

d) A asserção I é uma proposição falsa, e a asserção II é uma proposição verdadeira.

e) As asserções I e II são proposições falsas.

2) Leia o trecho a seguir:

"Nos últimos anos, o Brasil enfrentou (ou ainda enfrenta) uma epidemia de sífilis, causada pela bactéria Treponema pallidum. Os dados oficiais sobre a infecção sexualmente transmissível (IST) vão até junho de 2022, o que deixa médicos e especialistas no escuro sobre o avanço da doença.

Em 2021, foram diagnosticados mais de 167 mil novos casos de sífilis adquirida, 74 mil casos em gestantes e 27 mil ocorrências de sífilis congênita (quando a mãe transmite a doença para o filho, de forma acidental), segundo o Ministério da Saúde. Até onde se sabe, este foi o pior ano da doença no Brasil" (AGÊNCIA AIDS, 2023, on-line).

AGÊNCIA AIDS. Portal Terra: como está a epidemia da sífilis no Brasil? 25 fev. 2023. Disponível em: https://agenciaaids.com.br/noticia/portal-terra-como-esta-a-epidemia-de-sifilis-no-brasil/#:~:text=Nos%20%C3%BAltimos%20anos%2C%20o%20Brasil%20enfrentou%20(ou%20ainda%20enfrenta),sobre%20o%20avan%C3%A7o%20da%20doen%C3%A7a. Acesso em: 18 abr. 2023.

Considerando as informações apresentadas, FAÇA o que se pede nos itens a seguir.

a) COMPARE os fundamentos dos testes imunológicos treponêmicos e não treponêmicos.

b) CITE um teste imunológico treponêmico e um não treponêmico utilizado na rotina diagnóstica laboratorial.

c) MENCIONE e DESCREVA o fenômeno observado ao realizar um teste não treponêmico, em que o resultado seja negativo, sem diluição, e positivo, diluindo-se a amostra do paciente em 1:8.

3) Leia o trecho a seguir:

"A sífilis é uma Infecção Sexualmente Transmissível (IST) curável e exclusiva do ser humano, causada pela bactéria Treponema pallidum. Pode apresentar várias manifestações clínicas e diferentes estágios (sífilis primária, secundária, latente e terciária).

Nos estágios primário e secundário da infecção, a possibilidade de transmissão é maior. A sífilis pode ser transmitida por relação sexual sem camisinha com uma pessoa infectada ou para a criança durante a gestação ou parto.

A infecção por sífilis pode colocar em risco não apenas a saúde do adulto, como também pode ser transmitida para o bebê durante a gestação. O acompanhamento das gestantes e parcerias sexuais durante o pré-natal é fundamental pois viabiliza o diagnóstico e tratamento adequado, evitando assim a transmissão para o recém-nascido" (SESA, [2023], on-line).

SESA. O que é Sífilis? [2023]. Disponível em: https://saude.es.gov.br/sifilis. Acesso em: 18 abr. 2023.

A partir dos dados fornecidos, AVALIE as asserções a seguir e a relação proposta entre elas.

I - VDRL é a sigla usada para Venereal Disease Research Laboratory, que é um método utilizado para o diagnóstico confimativo de pacientes com sífilis. Baseia-se na utilização de partículas de colesterol revestidas com cardiolipina e lecitina, que reagem com os anticorpos presentes na amostra.

PORQUE

II – O teste baseia-se na pesquisa de anticorpos não treponêmicos presentes no soro ou no plasma, os quais são produzidos durante o processo infecioso.

A respeito dessas asserções, ASSINALE a alternativa correta.

a) As asserções I e II são proposições verdadeiras, e a II é uma justificativa correta da I.

b) As asserções I e II são proposições verdadeiras, e a I é uma justificativa correta da II.

c) As asserções I e II são proposições falsas, e uma não pode ser justificativa para outra.

d) A asserção I é uma proposição verdadeira, e a II é falsa.

e) A asserção II é uma proposição verdadeira, e a I é falsa.

Orientação de resposta

1) D.

a) Resposta pessoal.

3) E.

Referências

BRASIL. Diagnóstico da Sífilis: Aula 2. Brasília: Ministério da Saúde, [s. d.]. Disponível em: https://telelab.aids.gov.br/moodle/pluginfile.php/22193/mod_resource/content/1/S%C3%ADfilis%20-%20Manual%20Aula%202.pdf. Acesso em: 18 abr. 2023.

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