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Profa. Dra. Juliana Cogo
Introdução
Introdução
Determinação qualitativa de anticorpos autoantígeno de superfície (anti-HBsAg) da hepatite B
As hepatites virais agudas e crônicas são doenças provocadas por diferentes agentes etiológicos, com tropismo primário pelo tecido hepático, apresentando características epidemiológicas, clínicas e laboratoriais semelhantes, porém com importantes particularidades. Podem ser causadas por cinco vírus: o vírus da hepatite A (HAV), o vírus da hepatite B (HBV), o vírus da hepatite C (HCV), o vírus da hepatite D (HDV) e o vírus da hepatite E (HEV). Essas infecções têm um amplo espectro clínico que varia desde formas assintomáticas, anictéricas e ictéricas típicas até a insuficiência hepática aguda grave (fulminante).
A maioria das hepatites virais agudas é assintomática, independentemente do tipo de vírus, fato que dificulta o diagnóstico e tratamento. Os vírus da hepatite B e C possuem capacidade de cursar para a forma crônica, as manifestações clínicas aparecem apenas em fases adiantadas de acometimento hepático e incluem, muitas vezes, fibrose, cirrose hepática, carcinoma hepatocelular e comprometimento de outros órgãos. Vale ressaltar que, nas hepatites B e C, a definição de suas formas crônicas ocorre pela presença de replicação viral persistente por mais de seis meses.
O HBV pertence à família Hepadnaviridae (vírus de DNA hepatotrópicos) que engloba vírus capazes de infectar diferentes animais. A partícula viral infecciosa do HBV inclui um nucleocapsídeo proteico (HBcAg) envolto por um envelope lipoproteico originado da última célula infectada pelo vírus, contendo as três formas do antígeno de superfície viral (HBsAg). Ainda dentro da partícula, está presente a enzima DNA polimerase viral, a qual completará o genoma do vírus durante a infecção.
Apesar de todos os recentes avanços em relação ao diagnóstico, ao tratamento e à profilaxia da hepatite B, esta mantém-se como um importante problema de saúde pública nos dias atuais. Os estudos epidemiológicos, abordando a questão da distribuição dessa hepatite em populações, são pouco frequentes e, geralmente, limitam-se a grupos específicos, como doadores de sangue e gestantes.
A vacina contra a hepatite B (composta pelo antígeno HBs) faz parte do calendário de vacinação da criança e está disponível nas salas de vacina do Sistema Único de Saúde (SUS).
Com a suspeita de infecção pelo HBV, é o aparecimento de marcadores sorológicos do vírus que estabelecerá o diagnóstico da doença. A Tabela 1 apresenta os marcadores utilizados no diagnóstico de infecção pelo HVB.
Tabela 1 - Marcadores sorológicos utilizados no diagnóstico de infecção pelo vírus da hepatite B
Fonte: adaptada de Brasil (2005).
A partir da determinação desses marcadores, podemos indicar se houve infecção aguda ou crônica, cura ou, até mesmo, imunização.
Interpretação dos testes sorológicos
HBsAg reagente: presença de infecção pelo HBV, podendo ser aguda ou crônica.
HBsAg não reagente: ausência de infecção pelo HBV.
HBsAg reagente e anti-HBc IgM reagente: hepatite aguda.
HBsAg reagente e anti-HBc total reagente: presença de infecção pelo HBV.
Anti-HBs reagente e Anti-HBc total reagente: cura de infecção prévia com imunidade permanente para o HBV.
HBsAg não reagente e Anti-HBc total reagente: indicação de infecção passada pelo HBV ou de uma infecção do vírus da hepatite delta (HDV) com supressão do HBsAg.
Anti-HBs reativo isolado: proteção pós-vacina.
O teste de Elisa para a pesquisa de anti-HBs é um teste imunoenzimático, tipo sanduíche. As cavidades da placa de microtitulação são cobertas com antígeno HBsAg (fase sólida), amostras de soro ou plasma contendo anticorpos anti-HBsAg são adicionadas às cavidades juntamente com um conjugado HBsAg marcado com peroxidase. Após a incubação, haverá a formação de um complexo antígeno-anticorpo-antígeno representado pelo conjugado HBsAg marcado com peroxidase, pelo anticorpo anti-HBsAg da amostra e pelo antígeno HBsAg ligado à cavidade da microplaca.
O material não ligado é removido por lavagem. Um substrato (TMB + peróxido de hidrogênio) é adicionado, o qual desenvolverá cor azul nas cavidades onde a enzima peroxidase estiver presente, indicando a presença do anticorpo anti-HBsAg. A adição de uma solução stop ácida para bloqueio da reação enzimática mudará a cor da solução para amarela. A absorbância é, então, medida a 450 nm. A concentração do anticorpo anti-HBsAg é diretamente proporcional à intensidade da cor da reação
Materiais e
Equipamentos
Materiais e
Equipamentos
Luvas.
Kit Imuno-Elisa Anti-HBsAg (Wama, 416096-E).
Pipetas e ponteiras.
Vidraria.
Cronômetro.
Água destilada ou deionizada.
Incubador com temperatura de 37ºC.
Leitora de microplaca que possua filtro com banda de passagem de até 10 nm e leitura média de densidades óticas de 0-3 D.O em 450 nm.
Lavadora automática de placas (opcional).
Agitador de microplaca (opcional).
POP
POP
Amostras: soro ou plasma (sem hemólise).
Nota: é recomendado que as medidas de absorbância bicromática usem, quando disponível, um filtro de referência com comprimento de onda de 630 nm. Nessa condição, o uso do blank deve ser desconsiderado, ao contrário de quando é utilizado um único filtro de 450 nm.
Procedimento
Procedimento
Antes da realização do teste, espere que os reagentes, controles e amostras atinjam a temperatura ambiente (15-25ºC).
Preparo da solução de lavagem
Preparo da solução de lavagem
Tampão de lavagem 20 x concentrado (2): tampão salino-fosfato (PBS), pH 7,4, contendo Tween 20 como detergente. Diluir o volume do concentrado completando para 570 ml com água destilada ou deionizada. Se houver presença de cristais no tampão concentrado, eles devem ser dissolvidos a 37ºC antes da diluição. Durante cada ciclo de lavagem, cada cavidade deve ser completada com aproximadamente 350 μl do tampão diluído. Deixe atingir a temperatura ambiente (20-25ºC) antes de usar.
Nota: caso a solução de lavagem concentrada apresente cristais, aquecer a 37ºC até a dissolução completa deles.
Dosagem
Dosagem
De acordo com o plano estabelecido de distribuição na placa:
Usar 3 cavidades para o soro-controle negativo.
Usar 2 cavidades para o soro-controle positivo.
Usar 1 cavidade para o blank, o qual conterá somente 50 μL do substrato cromógeno – Solução A e 50 μL do substrato cromógeno – Solução B.
Tabela 2 - Exemplo de esquema de distribuição na microplaca
Fonte: a autora.
Dispensar 50 μL dos soros-controle positivo e negativo (sem diluir), conforme o estabelecido no item 1.
Dispensar 50 μL das amostras nas outras cavidades a serem testadas. Usar ponteiras individuais para cada pipetagem, a fim de evitar contaminação.
Dispensar 50 μL do conjugado em todas as cavidades, exceto no blank.
Homogeneizar levemente, batendo com os dedos nas bordas da placa, ou por vibração mecânica (agitador de placa) por 30 segundos.
Cobrir a placa com folha adesiva e incubar a 37ºC por 60 minutos.
Descartar o conteúdo da placa dentro de um recipiente que contenha solução desinfetante, tendo o cuidado de evitar contaminação entre as cavidades.
Lavar a placa 5 vezes com a solução de lavagem diluída.
7.1 Aspirar o conteúdo da microplaca.
7.2 dispensar 350 μL de solução de lavagem diluída em cada cavidade.
7.3 aguardar 30 segundos e esvaziar o conteúdo das cavidades.
Repetir 4 vezes este procedimento (total de 5 ciclos). Recomenda-se o uso de uma lavadora de microplaca manual ou automática.
Atenção: o correto procedimento de lavagem é fundamental para a boa performance do ensaio.
Após a última lavagem, inverter a placa e batê-la sobre papel absorvente para remover todo o líquido residual.
Dispensar 50 μL do substrato cromógeno – Solução A e 50 μL do substrato cromógeno – Solução B em cada cavidade da microplaca, inclusive no blank. Haverá o desenvolvimento de cor azul onde a enzima peroxidase estiver presente. Homogeneizar levemente, batendo com os dedos nas bordas da placa, ou por agitação mecânica (agitador de placa) por 30 segundos.
Incubar a 37°C por 15 minutos, protegendo da luz.
Bloquear a reação dispensando 50 μL da solução stop em cada cavidade da microplaca, inclusive no blank. A cor da solução mudará para amarela. Homogeneizar levemente, batendo com os dedos nas bordas da placa, ou por agitação mecânica (agitador de placa) por 30 segundos.
Ler a absorbância (D.O.) em um leitor de microplaca com filtro de 450 nm contra o blank do substrato, dentro de 5 minutos.
Interpretação dos resultados
Interpretação dos resultados
Determinar para cada teste e soros-controle, a densidade óptica (D.O.), cujo valor final é obtido pela subtração da leitura da D.O. do blank.
Determinar o valor do cut-off
Determinar o valor do cut-off
Cut-off = média da D.O. dos controles negativos x 2,1
Atenção: se o valor médio da D.O. dos controles negativos é menor do que 0,05, ele deve ser considerado 0,05. Se o valor é maior do que 0,05, deve ser considerado o valor da D.O. medida, respeitando o critério de validação do teste.
Exemplo: valor médio dos controles negativos = 0,03. Então, cut-off = 0,05 x 2,1 = 0,105
Validação do teste
Validação do teste
O teste é válido se:
A D.O. do blank, que contém somente substrato cromógeno A e B e solução stop, ser menor do que 0,080 a 450 nm.
O valor da D.O. dos controles negativos deve ser menor do que 0,100 a 450/630 nm ou a 450 nm, após subtrair o blank.
O valor da D.O. dos controles positivos deve ser igual ou maior do que 0,800 a 450/630 nm ou a 450 nm, após subtrair o blank.
Interpretação dos resultados
Interpretação dos resultados
Dividir o valor da D.O. da amostra do paciente pelo valor do cut-off. O teste é considerado:
Reagente: se valor igual ou maior do que 1,1.
Duvidoso (borderline): se valor entre 0,9 e 1,1.
Não reagente: se valor menor do que 0,9.
Atenção: é sempre recomendado repetir o teste nas amostras reagentes.
Sensibilidade analítica
Sensibilidade analítica
O Imuno-Elisa Anti-HBsAg (qualitativo) tem sensibilidade de 5 mUI/mL.
Na Prática
Na Prática
Verifique seu Aprendizado
Verifique seu Aprendizado
1) A hepatite é uma doença inflamatória do fígado que pode ser desencadeada por vírus, uso de medicamentos, doenças autoimunes, entre outros, constituindo um grave problema de saúde pública. O quadro a seguir demonstra as alterações nos marcadores virais no soro de dois pacientes:
Considerando os resultados apresentados na tabela, assinale a alternativa correta:
a) O paciente 1 apresenta hepatite A e B aguda, e o paciente 2 apresenta superinfecção por hepatite B e D.
b) O paciente 1 apresenta hepatite B aguda e hepatite A passada, e o paciente 2 apresenta superinfecção por hepatite B e D.
c) O paciente 1 apresenta hepatite B aguda e hepatite A passada, e o paciente 2 apresenta coinfecção por hepatite B e D.
d) O paciente 1 apresenta infecção passada por hepatite A e B, e a paciente 2 apresenta hepatite B
e) O paciente 1 apresenta hepatite A e B aguda, e o paciente 2 apresenta coinfecção por hepatite B e D.
2) Com base em nossos estudos, leia as afirmativas, a seguir, a respeito da hepatite B:
I. A hepatite B é causada pelo HBV, o qual é um vírus de RNA, transmitido por via parenteral (sangue e órgãos), contato sexual, fluidos corporais e vertical.
II. O AgHBS é o primeiro marcador que aparece no curso da infecção pelo HBV. Na hepatite aguda, ele declina a níveis indetectáveis em até 24 semanas.
III. O anti-HBc é o único anticorpo que confere imunidade ao HBV. Está presente no soro após o desaparecimento do HBsAg, sendo indicador de cura e imunidade.
IV. O anti-HBs pode ser encontrado, isoladamente, em pessoas vacinadas.
V. Anti-HBc IgM, anti-HBc total, AgHBs reagentes e anti-HBs não reagente indicam infecção recente pelo vírus do HBV.
Está correto o que se afirma em:
a) I e II, apenas.
a) I, II e V, apenas.
b) II, III, IV e V, apenas.
c) II, IV e V, apenas.
d) I, II, III, IV e V.
3) A infecção pelo vírus da hepatite B bem como a manifestação clínica em fase avançada constituem importantes preocupações para a saúde pública. Com relação aos diferentes métodos empregados no imunodiagnóstico, faça uma representação/desenho que demonstre as diferentes etapas da técnica de Elisa realizada nesta aula prática.
Orientação de resposta
Orientação de resposta
1) C. O paciente 1 apresenta hepatite B aguda e hepatite A passada, e o paciente 2 apresenta coinfecção por hepatite B e D.
2) C. As afirmativas II, IV e V estão corretas.
3)
Referências
Referências
BRASIL. Manual de Aconselhamento em Hepatites Virais. Brasília: Ministério da Saúde; Secretaria de Vigilância em Saúde; Departamento de Vigilância Epidemiológica, 2005.
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