Técnica de coloração de Ziehl Neelsen para pesquisa de coccídeos intestinais
Os coccídeos intestinais são importantes patógenos por serem considerados protozoários emergentes e oportunistas, que, apesar de sua distribuição cosmopolita, são importantes causas de morbidade e mortalidade em todo o mundo, ganhando maior notoriedade em países em desenvolvimento, onde comumente são consideradas um grave problema de saúde pública, relacionado à deficiência de saneamento básico, falta de acesso à água potável e sistemas de saúde ineficientes.
As crianças são comumente acometidas por enteroparasitoses em geral, seja por ainda apresentarem um sistema imunológico em desenvolvimento ou pela maior facilidade de entrarem em contato com as vias de transmissão. Além disso, outro importante grupo de risco são indivíduos imunocomprometidos, tais como os pacientes com HIV/AIDS, transplantados, leucêmicos ou em tratamento quimioterápico, que apresentam sintomas das coccidioses intestinais mais severos, o que eleva as taxas de mortalidade.
Os coccídeos intestinais compreendem um grupo de protozoários pertencentes ao filo Apicomplexa, possuindo estruturas apicais que auxiliam na invasão da célula hospedeira, podendo ser encontrados em várias espécies de aves e outros animais como bovinos, suínos, equinos, e algumas espécies são capazes de parasitar o organismo humano, especificamente células epiteliais do intestino.
As manifestações clínicas causadas por esses protozoários variam desde diarreia autolimitada, dor abdominal, dor de cabeça e febre em indivíduos imunocompetentes a morbidades decorrentes dessas parasitoses, dentre as quais podem ser alterações intestinais que geralmente culminam na síndrome da má absorção e, consequentemente, desnutrição, perda de peso, anemia, diminuição no crescimento e retardo cognitivo na população afetada. Entretanto, em imunocomprometidos, pode ocorrer diarreia crônica associada a distúrbios eletrolíticos, podendo levar à morte do hospedeiro.
O ciclo de vida dos coccídeos intestinais completa-se dentro de um único hospedeiro (monoxênico), envolvendo seis estágios de desenvolvimento (excistação, merogonia, gametogonia, fertilização, formação da parede do cisto e esporogonia), o que caracteriza o ciclo dos coccídeos intestinais.
Dentre as coccidioses, podemos destacar as infecções causadas por Cryptosporidium sp, Cyclosporasp e Isospora sp, necessitando de diagnóstico por meio de técnicas de identificação de ocistos desses protozoários presentes nas fezes do indivíduo.
Amostra de fezes (frescas ou preservadas em formaldeído a 10%) previamente concentradas por sedimentação ou flutuação.
Solução de fucsina-fenicada
Pipeta Pasteur plástica
Gazes
Álcool
Solução de álcool ácido
Papel filtro
Solução de azul-de-metileno a 0.3%
Resina sintética para montagem – Cytoseal 60 (opcional)
Lamínulas
Microscópio óptico
Técnica de coloração de Ziehl Neelsen
Preparar um esfregaço com a amostra de fezes previamente concentrada;
Deixar secar à temperatura ambiente ou em estufa a 70℃ por 10 min;
Corar com fucsina-fenicada, aquecendo a lâmina até a emissão de vapores por 5 min. Essa etapa deve ser realizada preferencialmente em capela de exaustão;
Escorrer o corante e lavar com água corrente;
Diferenciar com solução de álcool ácido;
Lavar com água corrente;
Corar o fundo com solução de azul-de-metileno a 0.3% por 1 min;
Lavar com água corrente e secar;
Examinar ao microscópio com objetiva de imersão (100X);
Os oocistos apresentam coloração que varia do púrpura ao vermelho intenso, sendo possível observar esporozoítos no interior dos oocistos.
Figura 1 - Técnica de coloração de Ziehl Neelsen
Fonte: UFG ([2023], on-line).
Focalizando o material...COMO LIGAR E FOCALIZAR O MICROSCÓPIO PARA ANÁLISE DE LÂMINAS CORADAS
Retirar a capa;
Conferir a voltagem (110v ou 220v) e inserir na tomada;
Conferir se a intensidade da luz está no mínimo (caso não estiver, reduzir) e ligar o interruptor (ligar o interruptor apenas quando a intensidade da luz estiver no mínimo);
Aumentar a intensidade da luz para o máximo;
Deixar na objetiva de 4x;
Abaixar a mesa (platina);
Prender a lâmina na pinça e centralizar a luz no material;
Ajustar o condensador (intensidade máxima – sem tocar na lâmina) e o diafragma (deixar aberto - intensidade de luz máxima);
Com os olhos nas lentes oculares, utilizar o macrômetro para subir a mesa até focalizar na objetiva de 4X;
Após focalização, mudar objetiva para a de 10x e focalizar utilizando apenas o micrômetro;
Mudar para o aumento de 40x e focalizar utilizando apenas o micrômetro;
Deixar a lâmina entre as objetivas e pingar apenas uma pequena gota do óleo de imersão (na ‘mira’ da luz) para colocar no aumento de 100x. Focalizar utilizando apenas o micrômetro.
Figura 2 - Cryptosporidium sp - Oocistos
Fonte: a autora.
Figura 3 - Cyclospora sp Oocistos
Fonte: a autora.
Figura 4 - Isospora sp - Oocistos
Fonte: a autora.
1) As espécies do gênero Cryptosporidium são protozoários que infectam a maioria dos animais e representam uma causa significante de morbidade e mortalidade. A criptosporidiose é uma das causas mais comuns de diarreia não viral em humanos, de ocorrência mundial.
Com relação ao C. parvum analise as afirmativas a seguir.
I. Dentre as diversas formas de transmissão da criptosporidiose, destaca-se principalmente ingestão de carnes malpassadas contaminadas com os oocistos.
II. Os oocistos infectantes são altamente resistentes aos fatores ambientais, incluindo o cloro, largamente utilizado no tratamento de água de abastecimento.
III. Os oocistos são inativados pela maioria dos desinfetantes empregados em serviços de saúde (álcool, glutaraldeído, ácido peracético, ortoftaldeído, fenóis e quaternário de amônia).
Está correto o que se afirma em:
a) I, apenas.
b) II, apenas.
c) III, apenas
d) I e III, apenas.
e) I, II e III.
2) Os coccídeos compreendem um grupo grande de parasitas apicomplexantes, que possuem uma fase sexuada no trato intestinal de animais invertebrados e vertebrados. Os gêneros Isospora, Sarcocystis, Cryptosporidium e Cyclospora infectam o intestino humano. Sobre o gênero Isospora, não é correto afirmar:
a) Diarreia grave pode ocorrer nos hospedeiros imunocomprometidos, após infecção com Isospora.
b) Isospora belli apresenta desenvolvimento sexuado e assexuado no citoplasma das células epiteliais do intestino delgado.
c) O desenvolvimento sexual resulta na produção oocistos, que são eliminados nas fezes e amadurecem para o estágio infectante no meio ambiente.
d) O diagnóstico é confirmado por meio da visualização de oocistos nas amostras fecais, geralmente nas preparações a fresco ou em preparações de concentração.
e) O diagnóstico pode ser confirmado por meio da visualização de vermes adultos dentre de oocistos infectantes.
1) B.
2) E.
UFG. Leitura de Lâminas de Ziehl-Neelsen. [2023]. Disponível em: https://publica.ciar.ufg.br/ebooks/iptsp/bacteriologia_basica/artigo_1.html. Acesso em: 25 abr. 2023.