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Prof. Marcel Rangel
Introdução
Introdução
O objetivo da aula está relacionado ao estudo do controle glicêmico em longo prazo, uma vez que esta metodologia analisa a concentração de glicemia presente na hemácia que, normalmente, tem tempo de vida em torno de 120 dias.
A hemoglobina glicada (Hb-G) resulta da fixação não enzimática da glicose no aminoácido valina terminal da cadeia beta da hemoglobina. Em adultos normais, há 97-98% de Hb-A, 2,5% de Hb-A2 e 0,5% de Hb-F. Assim, analisando que o controle glicêmico dos pacientes é fundamental em longo prazo, o exame torna-se imprescindível na conduta farmacológica de monitoramento de sua eficácia.
O sangue total é hemolisado e, então, cromatografado em uma resina de troca catiônica na qual as hemoglobinas são retidas e, somente, a Hb A é eluída de forma específica. A fração, ou, apenas, A1C corresponde à hemoglobina glicada propriamente dita, cujo terminal valina da cadeia beta está ligado à glicose, por meio de uma ligação estável e irreversível. A sua concentração reflete, na realidade, a média ponderada dos níveis glicêmicos de 60 a 90 dias antes do exame.
Materiais e
Equipamentos
Materiais e
Equipamentos
Amostra biológica fresca ou centrifugada.
Luvas.
Tubo a vácuo.
Centrífuga.
Ependorf.
Micropipetas 50 μL, 200 μL e 1000 μL.
Kit hemoglobina glicada – Cromatografia de troca iônica.
Béquer 25 mL.
Estante de micropipetas.
Ponteira para micropipetas.
Banho-maria a 37 ºC.
Cronômetro.
Aparelho espectrofotômetro.
Descarte com parede rígida.
EPIs: avental, máscara, luvas descartáveis.
Identificação dos Reagentes
Identificação dos Reagentes
Conservar entre 15 30 ºC.
Hemolisante.
Tampão.
Eluente.
Colunas – Contêm resina de troca catiônica equilibrada com tampão-fosfatos.
Amostra Sangue Total
Amostra Sangue Total
EDTA ou heparina.
A HbA é estável por sete dias, entre 2 e 8 ºC.
Procedimento do Teste
Procedimento do Teste
Identificação dos reagentes (conservar entre 15 - 25ºC).
Identificação dos reagentes (conservar entre 15 - 25ºC).
1. Resina LIGANTE: (TAMPA VERMELHA) contendo cada um 2,50mL de suspensão de resina de troca catiônica fraca, em tampão pH 7,00.
2. Resina NÃO-LIGANTE: 25 tubos (TAMPA CINZA) contendo cada um 2,50 mL de suspensão de resina de troca catiônica fraca, em tampão pH 8,50.
3. Hemolisante: 01 frasco com 14 mL de solução hemolisante em tampão pH 6,90, ácido bórico 1 mol/L, detergente não iônico 0,25%, cianeto de potássio 12 mmol/L e azida sódica 0,1 g/dL.
AMOSTRA SANGUE TOTAL EM EDTA
• A HbA é estável por 7 dias entre 2-8ºC.
Procedimento do Teste
Procedimento do Teste
Preparo do Hemolisado
Adicionar 0,05 mL de sangue total, homogeneizado, a 0,5 ml de Hemolisante em tubo de ensaio 12x75 mm. Homogeneizar bem e aguardar 5 minutos na temperatura ambiente. Se a hemólise for incompleta, centrifugar a 3.000 rpm por 5 minutos e usar o sobrenadante
Teste
Teste
1. TUBO A1 --> Homogeneizar por inversão (antes de adicionar o hemolisado) um tubo com tampa vermelha contendo a Resina ligante e, em seguida, adicionar 0,1 mL do hemolisado usando pipeta calibrada. Lavar a ponteira da pipeta na resina três vezes. Recolocar a tampa e homogeneizar por inversão (três vezes). Este tubo, contendo a resina ligante, deixará a glicohemoglobina no sobrenadante.
2. TUBO A2 --> Homogeneizar por inversão (antes de adicionar o hemolisado) um tubo com tampa cinza contendo a Resina não-ligante e, em seguida adicionar 0,02 mL do hemolisado usando pipeta calibrada. Lavar a ponteira da pipeta na resina três vezes. Recolocar a tampa e homogeneizar por inversão (três vezes). Este tubo, contendo a resina não ligante, deixará o total de hemoglobina no sobrenadante.
ATENÇÃO: Se após a homogeneização dos tubos contendo a Resina Ligante, (tampa vermelha) estes não receberem o hemolisado em no máximo dois minutos, os tubos deverão ser re-homogeneizados antes da adição do hemolisado. A seguir, retirar a tampa e prosseguir como descrito no quadro de procedimento. A inobservância deste cuidado pode levar a resultados não reprodutíveis. Estes cuidados não são necessários para a Resina Não Ligante (tampa cinza).
A seguir, homogeneizar por inversão, ambos os tubos, durante 5 minutos. Estas homogeneizações não necessitam ser contínuas: é suficiente homogeneizar durante 10 segundos a cada minuto. O tempo de 5 minutos representa o tempo mínimo; tempos maiores não interferem.
Centrifugar de 3 a 5 minutos a 3.000 rpm. Retirar os tubos da centrífuga com cuidado para não ressuspender a resina. Alternativamente à etapa de centrifugação, os tubos poderão ser deixados em repouso durante 20 minutos.
Pipetar, usando pipeta automática, 1 mL do sobrenadante dos tubos A1 e A2 diretamente para a cubeta do espectrofotômetro e determinar suas absorbâncias em 415 nm, acertando o zero com água destilada.
Cálculo
Cálculo
% de Glicohemoglobina = (Absorbância A1 ÷ Absorbância A2) x Fator*
*O Fator deve ser determinado utilizando o Calibrador Glico-Teck Katal.
Exemplo: A1 = 0,290 A2 = 0,800 Fator: 14
% de Glicohemoglobina = (0,290 ÷ 0,800) x 14 = 5%
Atualização sobre hemoglobina glicada (HbA1C) para avaliação do controle glicêmico e para o diagnóstico do diabetes aspectos clínicos e laboratoriais.pdfPrevalência de diabetes mellitus determinada pela hemoglobina glicada na população adulta brasileira.pdfDIABETES MELLITUS AVALIAÇÃO E CONTROLE ATRAVÉS DA GLICEMIA EM JEJUM E HEMOGLOBINA GLICADA.pdfNa Prática
Na Prática
Verifique seu Aprendizado
Verifique seu Aprendizado
1) Observe os resultados do exame dos pacientes, a seguir, e responda:
a) Calcule os valores, em %, de cada paciente.
b) Interprete os resultados de cada paciente, baseando-se nos valores de referência.
** Os valores discriminados, a seguir, foram estabelecidos pelo Diabetes Control and Complications Trial Research Group – DCCT e são aceitos em vários países para a população não diabética e para avaliação do grau de controle da glicose no sangue nos pacientes diabéticos.
4,0-6,5% Não diabético.
6,0-7,0% Objetivo do tratamento ou meta atingida.
7,0-8,0% Bom controle.
> 8,0% Diabético sem controle. Necessita atuação.
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