O fígado é considerado um dos principais órgãos do organismo com uma função imprescindível, principalmente no metabolismo, desse modo, a avaliação hepática é fundamental. Na avaliação, dosa-se duas enzimas: a alanina aminotransferase (ALT) e o aspartato aminotransferase (AST).
A alanina aminotransferase (ALT) é uma enzima encontrada, predominantemente, no fígado, em concentração moderada nos rins e em menores quantidades no coração e nos músculos esqueléticos. Na célula hepática, a ALT localiza-se no citoplasma (90%) e na mitocôndria (10%). Qualquer lesão (injúria) tissular ou doença que esteja afetando o parênquima hepático liberará maior quantidade da enzima para a corrente sanguínea, elevando os níveis séricos da ALT. A aspartato aminotransferase (AST) é uma enzima encontrada em concentração muito alta no músculo cardíaco, no fígado, e nos músculos esqueléticos e, em mais baixa concentração, nos rins e pâncreas. Nas células hepáticas, a AST localiza-se no citoplasma (40%) e na mitocôndria (60%), qualquer lesão tissular ou doença que esteja afetando o parênquima hepático liberará maior quantidade da enzima para a corrente sanguínea, elevando os níveis séricos da AST. Sempre que ocorrer uma lesão hepatocelular de qualquer etiologia, haverá grande liberação da enzima AST para a corrente sanguínea, o que elevará os seus níveis séricos.
A ALT catalisa a transferência do grupo amina da alanina para o cetoglutarato com formação de glutamato e piruvato. O piruvato é reduzido a lactato por ação da lactato desidrogenase (LDH), enquanto a + coenzima NADH é oxidada à NAD. A atividade enzimática da ALT na amostra é calculada com base na redução da absorbância em 340 nm, + quando o NADH se transforma em NAD. A AST catalisa a transferência do grupo amina do aspartato para o cetoglutarato com formação de glutamato e oxalacetato. O oxalacetato é reduzido a malato por ação da malato desidrogenase (MDH), enquanto a coenzima NADH é + oxidada à NAD. A atividade enzimática da AST na amostra é calculada com base + na redução da absorbância em 340 nm, quando o NADH se transforma em NAD.
Amostra biológica fresca ou centrifugada.
Luvas.
Tubo a vácuo.
Centrífuga.
Ependorf.
Micropipetas 10 μL, 100 μL e 1000 μL.
Kit alanina aminotransferase (ALT) – Cinético – UV.
Kit aspartato aminotransferase (AST) – Cinético – UV.
Béquer 25 mL.
Estante de micropipetas.
Ponteira para micropipetas.
Banho-maria a 37 ºC.
Cronômetro.
Aparelho espectrofotômetro.
Descarte com parede rígida.
EPIs: avental, máscara, luvas descartáveis.
Tampão – Contém tampão Tris 150 mmol/L, L-alanina 750 mmol/L, LDH > 2300 U/Le azida sódica 14,6 mmol/L.
Coenzima – Contém 2-cetoglutarato 75 mmol/L, NADH 1,3 mmol/L e azida sódica 14,6 mmol/L.
Tampão – Contém tampão Tris 121 mmol/L, L-aspartato 362 mmol/L, MDH 460 U/L, LDH 660 U/L e azida sódica 14,6 mmol/L.
Coenzima – Contém 2-cetoglutarato 75 mmol/L, NADH 1,3 mmol/L e azida sódica 14,6 mmol/L.
** A continuidade da metodologia é idêntica para as duas enzimas, a diferença ocorre na composição do tampão.
AMOSTRA SORO ou PLASMA (EDTAou heparina). O analito é estável por quatro dias entre 2 e 8 ºC. Não utilizar amostras hemolisadas.
Preparo do reagente de trabalho: o método exige que seja feito um reagente de trabalho, este deve ser produzido de acordo com a utilização. A recomendação é quando todo kit for utilizado, fazer a mistura na seguinte proporção: 4 mL de Tampão (1) mais 1 mLd e Coenzima (2). Este reagente é estável por 14 dias, entre 2 e 8°C.
Após a confecção do reagente de trabalho, proceder da seguinte forma:
Homogeneizar e realizar a leitura, o próprio equipamento fará a leitura das absorbâncias, após, exatamente, 1, 2 e 3 minutos, uma vez que a metodologia é cinética. Desse modo, as diferenças entre as absorbâncias devem ser, praticamente, iguais, indicando a linearidade do método.
Baseia-se no decréscimo de absorbância médio por minuto (DA/minuto médio).
U/Lde ALT/AST(GPT) = DA/minuto x 1746.
Onde:
DA/min = variação média da absorbância por minuto.
**O fator 1746 é calculado com base nas condições da reação cinética contínua.
CÁLCULO AST
PACIENTE 1: 1746 x 0,020 = 34,92 U/L
PACIENTE 2: 1746 x 0,030 = 52,38 U/L
PACIENTE 3: 1746 x 0,060 = 104,76 U/L
PACIENTE 4: 1746 x 0,020 = 34,92 U/L
PACIENTE 5: 1746 x 0,010 = 17,46 U/L
CÁLCULO ALT
PACIENTE 1: 1746 x 0,015 = 26,19 U/L
PACIENTE 2: 1746 x 0,020 = 34,92 U/L
PACIENTE 3: 1746 x 0,065 = 113,49 U/L
PACIENTE 4: 1746 x 0,015 = 26,19 U/L
PACIENTE 5: 1746 x 0,025 = 43,65 U/L
Assim, o Paciente 3 apresenta uma lesão hepática extensa com extravasamento das enzimas ALT e AST, ao mesmo tempo.